В корзине 0 товаров на сумму 0

ОСНОВЫ БИОХИМИИ

Учебное пособие для вузов.

Авторы:

Т. Л. Ауэрман, Т. Г. Генералова, Г. М. Суслянок

 

ОСНОВЫ БИОХИМИИ

 

В учебном пособии изложены основные сведения о строении, свойст- вах и биологических функциях белков, нуклеиновых кислот, углеводов, ли- пидов, витаминов. Рассмотрены важнейшие пути превращения веществ и энергии в живом организме. Приведены сведения об использовании биохи- мических процессов в пищевой промышленности.

Предназначено для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки 240700.62 «Биотехнология», 260100.62 «Продукты питания из растительного сырья», 260800.62 «Технология продукции и организации об- щественного питания». Может быть использовано студентами, обучающими- ся по другим специальностям, а также аспирантами.

 

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая химия, или биохимия, служит теоретической основой любой пищевой технологии, направленной на переработку сырья биологиче- ского происхождения. Поэтому в условиях модернизации российской эконо- мики изучение этой фундаментальной научной дисциплины обязательно при подготовке высококвалифицированных работников пищевой промышленно- сти.

Главной задачей биохимии является изучение структурных и функцио- нальных основ живой материи, т. е. исследование химического состава жи- вых организмов и закономерностей молекулярных процессов, обеспечиваю- щих их жизнедеятельность. При этом основная цель биологической химии заключается не в простом познании свойств и структурных особенностей изучаемых веществ, а в выяснении роли этих веществ в функционировании живых организмов.

Место биохимии в системе биологических дисциплин можно предста- вить, рассмотрев уровни структурной организации материи (рис. 1). Каждый уровень этого иерархического ряда служит объектом различных физических, химических и биологических исследований. Биологическая химия изучает явления, протекающие на макромолекулярном, клеточном уровне.

 

Атом       Молекула       Макромолекула                      Вирус            Клетка                Ткань Орган   Организм                Популяция                  Биоценоз                Биосфера

 

Биохимия — относительно молодая наука. Её зарождение относят к концу XVIII — началу XIX века, когда из организмов был впервые выделен ряд веществ — мочевина, яблочная и лимонная кислоты и др., хотя некото- рые биохимические явления были известны человеку уже в глубокой древно- сти. Однако в то время наука, занимавшаяся изучением веществ, входящих в состав животных и растительных организмов (веществ органического мира), называлась органической химией.

С середины XIX века её начали называть физиологической химией, а под органической химией стали понимать химию соединений углерода.

Только в конце XIX — начале XX века благодаря крупным достижени- ям в области органической химии и физиологии биохимия сформировалась как самостоятельная наука. Термин «биохимия» предложил в 1903 г. немец- кий химик К. Нойберг.

Итак, целью биохимии, как биологической дисциплины, является по- знание живой природы. В то же время, биологические процессы по своему механизму являются химическими, и именно химические методы использу- ются в качестве средства познания явлений живого мира. Поэтому биохимию часто называют химией жизни.

Однако дать определение понятию «живое», провести чёткую границу, отделяющую живое от неживого, весьма непросто. Ведь все живые организ- мы состоят из «неживых» молекул, обладающих признаками неживой мате- рии; их свойства и поведение описываются законами физики и химии. Вме- сте с тем живые организмы обладают рядом отличий, присущих исключи- тельно живой материи.

Важнейшей отличительной особенностью является наличие у живых организмов биологического обмена веществ, представляющего собой сово- купность происходящих в них химических превращений. Биологический об- мен веществ принято называть метаболизмом (греч. “μεταβολή” — переме- на). При всём многообразии живых организмов, населяющих Землю, основ- ные метаболические процессы и у микроорганизмов, и у растений, и у жи- вотных и у человека протекают по сходным механизмам, что свидетельству- ет о единстве всего живого.

Живые организмы неразрывно связаны с окружающей средой, из кото- рой они получают различные компоненты, необходимые для осуществления процессов жизнедеятельности. Они подвергают их всевозможным метаболическим превращениям, а затем выделяют в окружающую среду конечные продукты обмена.

Биологический обмен веществ состоит из двух противоположных про- цессов — ассимиляции (лат. “assimilatio” — уподобление), или анаболизма (греч. “άναβολή” — подъём), и диссимиляции (лат. “dissimilatio” — распо- добление), или катаболизма (греч. “καταβολή” — сбрасывание).

Ассимиляция представляет собой совокупность процессов синтеза ве- ществ в живом организме, т. е. процессов образования самой живой материи. Диссимиляция, напротив, является совокупностью процессов разрушения веществ. Конечные продукты диссимиляции живые организмы выделяют в окружающую среду, а промежуточные продукты наряду с веществами, по- ступающими из окружающей среды, используют как строительный материал в процессах ассимиляции.

Ассимиляция и диссимиляция представляют собой две стороны едино- го процесса биологического обмена веществ, благодаря которому непрерыв- но происходит самообновление живого организма.

Другой особенностью живой материи является высокий уровень её структурной организации. Практически все живые организмы имеют клеточ- ное строение. Различают клетки микроорганизмов, различных органов и тка- ней растений и животных. Однако при всём своём многообразии все клетки обладают рядом общих морфологических признаков, что является ещё одним свидетельством единства всего живого на Земле.

В структурной организации клетки различают несколько уровней. Пер- вый уровень составляют молекулы небольших размеров — аминокислоты, азотистые основания, моносахариды, жирные кислоты и др., которые явля- ются материалом для построения макромолекул — белков, нуклеиновых ки- слот, полисахаридов, липидов. Макромолекулы составляют второй уровень структурной иерархии в организации клетки. Из них формируются мембраны и внутриклеточные органеллы — ядро, митохондрии, рибосомы, лизосомы и др., образующие третий уровень структурной организации клетки.

А — клетка животного происхождения; Б — растительная клетка:

1 — ядро с хроматином и ядрышком; 2 — цитоплазматическая мем- брана; 3 — клеточная стенка; 4 — плазмодесмы; 5 — гранулярная эндоплаз- матическая сеть; 6 — гладкая (агранулярная) эндоплазматическая сеть; 7 — пиноцитозная вакуоль; 8 — аппарат Гольджи; 9 — лизосома; 10 — жировые включения в гладкой эндоплазматической сети; 11 — центриоль и микротру- бочки центросферы; 12 — митохондрии; 13 — полирибосомы гиалоплазмы; 14 — вакуоли; 15 — хлоропласты.

 

Важнейшей органеллой клетки является ядро — место хранения на- следственной информации и центр управление всеми процессами, проте- кающими в клетке. Ядро заключено в двумембранную оболочку, пронизан- ную ядерными порами, через которые оно обменивается различными веще- ствами с цитоплазмой.

Цитоплазма — обязательный компонент живой клетки, представляю-

щий  собой  внутреннюю  полужидкую  среду,  в  которой  протекают важные

 

метаболические процессы. Структуру цитоплазмы поддерживает разветвлён- ная эндоплазматическая сеть — система ограниченных мембраной мель- чайших трубочек, образующих транспортные пути, по которым внутри клет- ки перемещаются вещества. Пронизанная мембранами цитоплазма объединя- ет в одно целое ядро и все цитоплазматические органеллы, обеспечивая их взаимодействие.

С мембранами некоторых участков эндоплазматической сети связаны рибосомы — очень мелкие органеллы, не имеющие мембранного строения. На рибосомах осуществляется сложный процесс биосинтеза белков. Это

«микрофабрики белка». Многие рибосомы свободно лежат в цитоплазме. Не- которые внутриклеточные органеллы имеют собственные рибосомы.

Снаружи цитоплазму окружает тонкая оболочка — цитоплазматиче- ская мембрана, обладающая, как и все биологические мембраны, свойством избирательной проницаемости для веществ, поступающих в клетку и выво- дящихся из неё. Поступление веществ в клетку часто происходит против гра- диента концентрации.

Клетки растений, в отличие от животных клеток, окружены прочной оболочкой — клеточной стенкой, располагающейся поверх цитоплазмати- ческой мембраны. Клеточные стенки служат растениям каркасом, обеспечи- вающим их механическую прочность, защищают клетки от повреждений.

Внутриклеточные мембраны образуют клеточные органеллы, в кото- рых локализуются различные биохимические процессы. Так, аппарат Голь- джи, образованный ограниченными мембраной стопками цистерн, перехо- дящими по краям в пузырьки, участвует в формировании некоторых продук- тов жизнедеятельности клетки, в построении клеточной стенки растительных клеток. Это «регулировщик» клетки. По каналам эндоплазматической сети к нему поступают синтезированные клеткой вещества, которые сначала накап- ливаются здесь, а затем в отделившихся пузырьках поступают в цитоплазму. Эти вещества используются либо внутри клетки, либо вне её. Митохондрии

  • — двумембранные органеллы — отвечают за обеспечение клетки энергией.

 

Это «силовые станции» клетки. Лизосомы — одномембранные пузырьки — содержат ферменты, разрушающие белки, углеводы, жиры и другие компо- ненты клетки после её отмирания либо прекращения функционирования не- которой её части. Это органеллы «самопереваривания» клетки. Пластиды — специфические двумембранные органеллы растительных клеток — служат для протекания процесса фотосинтеза (хлоропласты), накопления запасных питательных веществ (лейкопласты), каротиноидов (хромопласты). Вакуоль

  • — ограниченный мембраной мешок, заполненный клеточным соком (вод- ным раствором различных соединений) — служит резервуаром воды, местом скапливания конечных продуктов обмена веществ, а также вместилищем ря- да запасных веществ. Вакуоль поддерживает тургорное давление раститель- ной клетки и нередко занимает до 90 % объёма зрелой клетки.

Если нарушается внутренняя структурная организация клетки, то такая клетка погибает. В ней перестают протекать процессы, присущие живой клетке, хотя её химический состав при этом не изменяется.

Группы клеток, совместно выполняющие общие функции и обладаю- щие сходным строением и происхождением, образуют ткани живых орга- низмов.

В теле высших растений различают шесть групп тканей. Образователь- ные, или меристематические (греч. “μεριστός” — делимый), ткани обеспе- чивают рост растения на протяжении всей его жизни. Покровные ткани за- щищают растения от неблагоприятных воздействий внешней среды. Основ- ные, или паренхиматические (греч. “παρά” — рядом + “έγχυμα” — разли- тое), ткани составляют основную массу тела растений, в которой располага- ются другие ткани. Механические ткани образуют прочный каркас, препят- ствующий повреждению органов растений. Специализированные структуры растения, способные выделять различные вещества, образуют выделитель- ные ткани.

У высших растений развита система проводящих тканей, объединяю- щих все органы растения в единое целое. Различают два типа проводящих

 

тканей — ксилему (греч. “ξύλον” — дерево) и флоэму (греч. “φλοῦς” — ко- ра). По ксилеме поглощённые корневой системой вода и растворённые в ней минеральные вещества поднимаются вверх через стебель растения к листьям. В противоположном направлении из листьев по флоэме в остальные части растения направляются органические вещества (продукты фотосинтеза).

У высших животных организмов различают четыре основных типа тканей. Эпителиальные (греч. “έπι” — сверх + “θήλη” — сосок) ткани обра- зуют внешние покровы и выстилают внутренние полости тела и внутренних органов животных, а также участвуют в образовании желёз. Соединитель- ные ткани выполняют опорную и защитную (хрящевая, костная ткани и др.), а также питательную функции (кровь, лимфа и др.). Мышечная ткань обла- дает свойством сократимости и выполняет двигательную функцию. Нервная ткань регулирует и координирует жизнедеятельность всех тканей, органов и систем животного организма, воспринимает сигналы из внешней среды и оп- ределяет ответные реакции на них.

Следующая особенность живой материи состоит в том, что не только отдельные внутриклеточные органеллы, клетки, ткани и органы живого ор- ганизма выполняют определённые функции, но даже молекулы. Каждая мо- лекула, необходимая клетке, играет свою роль в её жизнедеятельности. Ве- щества, образующие неживую природу, не наделены специфическими функ- циями.

Ещё одной важной особенностью живой материи является её способ- ность обеспечивать постоянный приток энергии в клетку для поддержания процессов жизнедеятельности организма. Клетка, извлекая энергию из пита- тельных веществ, расходует её на процессы биосинтеза новых необходимых клетке веществ, на совершение механической работы, на транспорт веществ через клеточную мембрану и др. Зелёные растения в качестве дополнитель- ного источника энергии используют энергию Солнца.

 

Энергетические процессы в клетке протекают иначе, чем в неживой природе. Механизмы преобразования энергии в ходе жизнедеятельности ор- ганизмов изучает специальная дисциплина — биоэнергетика.

Характерной особенностью живых организмов является также то, что все асимметричные молекулы — аминокислоты, углеводы, органические ки- слоты и др. — встречаются в живой природе только в виде L- или только в виде D-изомеров. В неживой природе с одинаковой частотой встречаются как L-, так и D-формы асимметричных молекул.

Наконец, ещё одно отличительное свойство живых организмов заклю- чается в их способности к размножению и сохранению из поколения в поко- ление своего вида. Объекты неживой природы не способны к самовоспроиз- ведению.

Для функционирования живого организма необходимы не только по- стоянный приток питательных веществ и энергии, но и информация о его развитии во времени. Все процессы в клетках живых организмов управляют- ся. Они протекают не хаотично, а строго скоординированно. Жизнь, таким образом, представляет собой триединый поток веществ, энергии и информа- ции.

Таким образом, хотя биохимические процессы в живых организмах осуществляются с участием тех же частиц, что и химические процессы в не- живой природе, биологическая форма движения материи принципиально от- личается от химической.

 

Логическая схема курса биологической химии

I.   БЕЛКИ

Это один из ключевых разделов биохимии, значение которого опреде- ляется прежде всего тем, что практически все процессы, протекающие в клетке, являются функцией белков. Именно поэтому белки называют матери- альной основой жизни или «рабочими» клетки.

 

1.1.   Из истории изучения белковых веществ

Целенаправленное изучение белковых веществ началось в XVIII веке, когда учёные, занимавшиеся исследованием живой материи, стали обращать внимание на то, что некоторые вещества, выделяемые из различных биоло- гических объектов, обладают сходными и во многом необычными свойства- ми. Так, эти вещества образовывали вязкие и клейкие растворы, которые при высушивании превращались в роговидную массу, а при нагревании перехо- дили из жидкого состояния в твёрдое (коагулировали), что не характерно для большинства химических веществ, в пламени они выделяли запах аммиака и палёной шерсти.

Поскольку всеми этими свойствами, как было известно, обладал яич- ный белок, то по аналогии данные вещества стали называть белковыми. Впервые этот термин употребил знаменитый французский экономист и фи- зиолог Ф. Кёнэ в 1747 г.

Примерно в это же время (в 1745 г.) была опубликована первая научная статья о белке. Её автор — итальянский учёный Я. Б. Беккари, выделивший ещё в 1728 г. из пшеничной муки клейковину и получивший таким образом первый препарат белкового вещества.

В последующие годы в результате работ французских химиков А. Ф. де Фуркруа, П. Ж. Маке и других учёных, белковые вещества были выделены в самостоятельный класс биологических молекул — класс белков.

В 1836 г. голландский химик Г. Я. Мульдер предложил первую модель химического строения белков. Он считал, что все белки содержат один или несколько общих радикалов, имеющих эмпирическую формулу 2C8H12N2 +

 

5O (в последующем она неоднократно корректировалась). А в 1838 г. Муль- дер по предложению шведского химика Я. Й. Берцелиуса назвал эту мини- мальную структурную единицу состава белков протеином (греч. “πρωτεῖος”

  • — первичный, первостепенный), а сами белковые вещества — протеинами. Впоследствии, однако, было доказано, что таких радикалов не сущест-

вует. Тем не менее, термин «протеины» прижился, но теперь он употребляет- ся как синоним термина «белки», что подчёркивает первостепенную важ- ность этих веществ в функционировании живой природы.

 

1.2.   Основные биологические функции белков

Белки входят в состав каждой клетки и составляют около 50 % её сухой массы. Они играют ключевую роль в обмене веществ, реализуют важнейшие биологические функции, лежащие в основе жизнедеятельности всех орга- низмов.

Среди большого разнообразия функций, выполняемых белками, перво- степенное значение имеют структурная, или пластическая, и каталитическая. Это универсальные функции, поскольку они присущи всем живым организ- мам, от микробной клетки до высших представителей растений и животных, включая человека.

Структурные белки формируют каркасы внутриклеточных органелл и внеклеточных структур, а также участвуют в стабилизации клеточных мем- бран. Таким образом, все клетки, а следовательно, и ткани, и организм в це- лом строятся из белков, которые и определяют структуру и форму органелл, клеток, тканей и всего организма.

Примерами структурных белков могут служить коллаген и эластин, со- ставляющие основу соединительной и костной тканей высших животных и человека. При кипячении коллагена образуется желатин, применяющийся в пищевой промышленности. К структурным белкам относятся кератины, со- ставляющие основу роговых производных эпидермиса кожи — волос, ногтей,

 

шерсти, когтей, рогов, копыт, перьев, клювов, панцирей, игл и т. п., а также фиброин шёлка, паутины.

Каталитически активными белками являются ферменты. Они уско- ряют почти все химические реакции, протекающие в живых организмах, обеспечивая тем самым необходимые для обменных процессов скорости.

Многие белки, присущие тем или иным группам живых организмов, выполняют специфические функции, среди которых наиболее важными яв- ляются транспортная, регуляторная, защитная, рецепторная, сократительная, запасная и некоторые др.

Транспортные белки переносят различные молекулы и ионы внутри организма. Например, гемоглобин с током крови переносит кислород от лёг- ких к тканям и диоксид углерода от тканей к лёгким у животных и человека, а миоглобин транспортирует кислород в мышцах. Сывороточный альбумин является переносчиком многих транспортируемых кровью веществ — жир- ных кислот, ионов некоторых металлов и др.

К белкам данной группы также относят специфические белки, с помо- щью которых различные вещества перемещаются через клеточные мембра- ны.

Регуляторные белки участвуют в регуляции обмена веществ как

внутри клеток, так и в целом организме. Например, такие сложные процессы, как биосинтез белков и нуклеиновых кислот, протекают под строгим «кон- тролем» множества регуляторных белков. Специфические белковые ингиби- торы регулируют активность многих ферментов.

Характерной особенностью этой группы белков является способность воздействовать на фундаментальные механизмы обмена веществ. Например, инсулин — это гормон белковой природы, вырабатываемый поджелудочной железой человека и животных. Он служит сигнальным веществом, регули- рующим концентрацию глюкозы в крови. При недостатке инсулина в орга- низме развивается тяжёлая болезнь — сахарный диабет.

 

Защитные белки формируют защитную систему живых организмов. Например, иммуноглобулины (антитела) и интерфероны предохраняют орга- низм от проникновения в его внутреннюю среду различных антигенов (от англ. “antibody generator” — производитель антитела) — вирусов, бактерий, чужеродных клеток и тканей. Они вырабатываются животными организмами в ответ на атаку патогенов или чужеродных частиц, распознают и инактиви- руют их, тем самым защищая организм от негативного воздействия антиге- нов.

Защитную функцию выполняет также белок свёртывающей системы крови фибриноген, препятствующий потере крови при повреждениях крове- носных сосудов.

Рецепторные белки воспринимают сигналы, поступающие из внешней среды, и воздействуют на внутриклеточные процессы. Например, белки- рецепторы, сосредоточенные на поверхности клеточных мембран, избира- тельно взаимодействуют с регуляторными молекулами (например, гормона- ми). А рецепторные белки органов чувств взаимодействуют с такими сигна- лами, как свет, цвет, вкус, запах, звук, и передают полученную информацию в биологические системы. Такими белками являются родопсин, участвующий в зрительном акте, вкусовой сладкочувствительный и обонятельный белки и др.

Сократительные белки обладают механохимическими свойствами, т. е. способностью преобразовывать свободную химическую энергию в меха- ническую работу. Например, белки мышц миозин и актин обеспечивают мышечное сокращение и расслабление.

Запасные белки представляют собой резервный материал, предназна- ченный для питания развивающихся клеток. Запасными белками являются яичный альбумин, глиадин пшеницы, зеин кукурузы, казеин молока и многие др.

Запасные белки — важнейший источник пищевого белка для человека, в особенности запасные белки семян растений. Эти белки обладают сущест-

 

венным биохимическим отличием от белков вегетативных частей растений (стеблей, листьев, корней). Будучи запасными, белки семян являются инерт- ными по сравнению с активно функционирующими на протяжении всего пе- риода жизни растений белками стеблей, листьев и корней. При прорастании семян запасные белки мобилизуются, что связано с их гидролизом.

Токсические белки вырабатывают некоторые организмы в качестве защиты от потенциальных врагов. Например, они встречаются в ядах змей, скорпионов, семенах растений (рицин клещевины, лектины бобовых и др.), у микроорганизмов (холерный, дифтерийный токсины и др.).

 

1.3.   Элементный состав и молекулярная масса белков

Первые анализы по установлению элементного состава белков, полу- ченных из разных источников, были сделаны в 1810 г. французскими учёны- ми Ж. Л. Гей-Люссаком и Л. Ж. Тенаром. В ходе последующих исследований было выяснено, что все белки состоят из сходного набора элементов.

Итак, было установлено, что в состав белков входят четыре обязатель- ных химических элемента — углерод, кислород, азот и водород. Большинст- во белков содержат также серу. Кроме этого, в некоторых белках присутст- вуют и другие элементы, чаще всего фосфор, железо, цинк и медь.

Элементный состав белков довольно постоянен. Они содержат 50–55 % углерода, 21–24 % кислорода, 15–18 % азота, 6,5–7,3 % водорода, до 2,4 % серы и до 0,5 % других элементов.

Таким образом, по содержанию основных химических элементов белки различаются незначительно, при этом наибольшим постоянством характери- зуется количество азота, обязательное присутствие которого в составе белков доказал в 1833 г. Гей-Люссак. Именно наличие этого элемента отличает их от таких широко распространённых в живой природе соединений, как углеводы и жиры. Поэтому белки часто отождествляют с азотсодержащими вещества- ми клетки.

 

На этой особенности элементного состава белков, а именно на опреде- лении содержания белкового азота, основан метод их количественного опре- деления в биологических объектах, предложенный в 1883 г. датским хими- ком И. Кьельдалем. Так как в большинстве случаев содержание азота в бел- ках составляет 16 %, т. е. 1 г азота содержится в 6,25 г белка (100 % : 16 % = 6,25), можно рассчитать количество белка, умножив найденное количество белкового азота на белковый коэффициент 6,25.

Другой особенностью белков является их громадная молекулярная масса. Её определяют различными способами: методом гель-фильтрации, электрофореза, масс-спектрометрии и др.

Молекулярные массы белков колеблются в очень широком диапазоне — приблизительно от 6000–10000 Да (дальтон) до 1000000 Да и выше (табл. 1). 1 Да = 1 а. е. м. » 1,66054·10–24 г.

Таблица 1

Значения молекулярных масс некоторых белков

 

Белок

Молекулярная масса, Да

Инсулин бычий

5733

Лизоцим яичный

13930

Миоглобин лошади

16890

Гордеин ячменного зерна

27500

Гемоглобин человека

64500

Альбумин сыворотки крови

66500

Эдестин семян конопли

310000

Уреаза соевых бобов

483000

Миозин

500000

Иммуноглобулины класса IgM

970000

Титин (белок мышц человека)

3700000

 

1.4.   Аминокислотный состав белков

В организме человека содержится огромное число различных белков.

Каждый организм содержит свои специфические белки.

При кипячении белков в концентрированных растворах кислот или ще- лочей происходит их полный гидролитический распад с образованием низ- комолекулярных продуктов — смеси аминокислот. Чаще всего гидролиз бел- ков проводят путём их кипячения в запаянных ампулах в течение суток в 6 н. растворе соляной кислоты при температуре около 105 °С:

 

6 н. HCl

Белок                          Смесь аминокислот 105 °C, 24 ч

 

Следовательно, аминокислоты являются основной структурной едини- цей белков. А белки, в свою очередь, представляют собой полимеры амино- кислот.

То, что именно аминокислоты являются мономерами сложных белко- вых молекул, впервые установил (в 1871 г.) русский химик Н. Н. Любавин, осуществивший ферментативный гидролиз белка. В 1894 г. немецкий биохи- мик и физиолог А. Коссель сформулировал теорию о том, что основными структурными элементами белков являются аминокислоты. Эта теория была экспериментально подтверждена в начале XX века немецким химиком Э. Г. Фишером.

К настоящему времени в биологических объектах обнаружено около 200 различных аминокислот. Однако, несмотря на огромное разнообразие белков в живой природе, в их построении принимает участие один и тот же набор из 20 аминокислот. Аминокислоты, участвующие в построении белко- вых молекул, называют протеиногенными (образующими белки), или «аз- букой белка». Каждая протеиногенная аминокислота имеет свой генетиче- ский код, определяющий её включение в белковую молекулу. Остальные природные аминокислоты называют непротеиногенными.

 

1.5.   Общие свойства протеиногенных аминокислот

По химической природе аминокислоты представляют собой органиче- ские соединения, содержащие в своём составе аминную группу –NH2 и кар- боксильную группу –СООН. Если аминогруппа соединена с α-углеродным атомом аминокислоты, т. е. атомом углерода, непосредственно связанным с карбоксильной группой, то такие аминокислоты называют α-аминокислота- ми. Структуру α-аминокислот можно выразить общей формулой:

 

Н      α-углеродный атом

|

аминная группа        H2N – C – COOH         карбоксильная группа

|

R         радикал

 

Все протеиногенные аминокислоты являются α-аминокислотами. Они имеют общую часть Н2Ν–СН–СООН и различаются между собой только своими радикалами (R-группами).

У всех протеиногенных аминокислот, за исключением простейшей аминоуксусной кислоты, α-углеродный атом соединён с четырьмя различны- ми заместителями и, следовательно, является асимметрическим. Аминокис- лоты с одним асимметрическим атомом углерода (*C) имеют два оптических изомера, которые являются зеркальным отражением друг друга. В зависимо- сти от расположения аминогруппы относительно остальных заместителей аминокислоты относят либо к D-ряду (лат. “dexter” — правый), либо к L-ряду (лат. “laevus” — левый):

 

СООН                                     CООН

|                                               |

H –*C – NH2                       H2N –*C – H

|                                               |

R                                             R

D-α-аминокислота                 L-α-аминокислота

 

Все протеиногенные аминокислоты являются L-α-аминокислотами. D- α-аминокислоты в живой природе встречаются редко, например, в составе клеточных стенок бактерий и антибиотиках.

В молекулах некоторых протеиногенных аминокислот присутствуют два асимметрических атома углерода. Для этих аминокислот возможно суще- ствование четырёх оптических изомеров.

Таким образом, протеиногенные аминокислоты обладают оптической активностью. Все они, за исключением аминоуксусной кислоты, будучи растворены в воде, способны вращать плоскость поляризации света. Значе- ние удельного вращения в большинстве случаев составляет от 20o до 30o вле- во или вправо.

Одновременное присутствие в молекулах аминокислот карбоксильных и аминных групп обуславливает их очень важное свойство — амфотерность (греч. “άμφότερος” — и тот и другой), т. е. способность проявлять в зависи- мости от реакции среды либо кислые, либо основные свойства.

Кислые свойства аминокислота проявляет путём диссоциации (лат. “dissociatio” — разъединение) карбоксильной группы, т. е. выделения иона водорода Н+ с образованием аниона –СОО, а основные свойства — путём протонирования аминогруппы, т. е. присоединения к ней иона водорода с об- разованием катиона +Н3N–.

В водном растворе могут одновременно протекать как процесс диссо- циации карбоксильных групп аминокислот, так и процесс протонирования аминогрупп. Поэтому аминокислоты в водном растворе представляют собой биполярные ионы (цвиттер-ионы, от нем. “Zwitter” — гермафродит), у кото- рых одновременно ионизированы и карбоксильная, и аминная группы. По- скольку карбоксильные группы в молекулах α-аминокислот проявляют свои кислые свойства сильнее, чем аминогруппы — основные, то водные раство- ры нейтральных аминокислот имеют слабокислую реакцию среды.

В сильнокислых растворах при избытке ионов Н+ аминокислоты суще- ствуют преимущественно в виде катионов: происходит протонирование ами-

 

ногрупп, тогда как диссоциация карбоксильных групп подавлена. В сильно- щелочных растворах при избытке ионов ОН, наоборот, интенсивно протека- ет диссоциация карбоксильных групп, в то время как существование прото- нированных аминогрупп затруднено. В этих условиях аминокислоты имеют преимущественно форму анионов:

 

+H3N – CH – COO

+ Н+                        |                          + ОН

– Н+              R           – ОН

+H3N – CH – COOH                                              H2N – CH – COO + H2О

|                                                                              |

R                              Аминокислота в                  R

Аминокислота в сильно-       водном растворе      Аминокислота в сильно- кислой среде в форме        (при рН 7) в форме    щелочной среде в форме

катиона                         цвиттер-иона                       аниона

 

Растворы α-аминокислот дают качественную реакцию при их нагрева- нии с кислым раствором избытка нингидрина. В ходе этой реакции выделя- ется углекислый газ, аминокислота превращается в соответствующий альде- гид, а две молекулы нингидрина соединяются друг с другом через азот сво- бодной аминной группы. При этом образуется соединение сине-фиолетовой окраски:

 

СО

 

2                       С(ОН)2  +  H2N – CH – COOH

|

СО                               R

Нингидрин                     Аминокислота

 

СО                    CO

О

 

СН–N=C

 

СО                    CO

 

+   R – С       +   СО2   +   3Н2О

Н

 

Соединение сине-фиолетового цвета       Альдегид

 

Реакция с нингидрином используется для идентификации и количест- венного определения аминокислот в хроматографическом анализе, в том числе в автоматических анализаторах аминокислот.

 

1.6.   Номенклатура и классификация протеиногенных аминокислот

Все протеиногенные аминокислоты имеют два названия: научное и тривиальное (традиционное). Научные названия аминокислот построены в соответствии с правилами, разработанными Международным союзом чистой и прикладной химии (International Union Pure and Applied Chemie IUPAC). Согласно научной номенклатуре ИЮПАК название соединения однозначно отражает его структуру. Однако такие названия сложны и поэтому на прак- тике пользуются традиционными наименованиями аминокислот, историче- ски связанными с названиями объектов, в которых они впервые были обна- ружены, или c какими-либо их особыми свойствами. В большинстве случаев тривиальные наименования аминокислот оканчиваются на «-ин», что под- чёркивает принадлежность этих соединений к аминам.

Более того, для удобства аминокислоты обозначают также символами, используя первые три буквы их русского или английского традиционного наименования, либо даже одну букву.

Существуют различные классификации протеиногенных аминокислот: химическая, физико-химическая, биологическая и др. Согласно химической классификации их систематизируют в соответствии с химической природой боковых радикалов, физико-химическая классификация основана на разли- чиях их физико-химических свойств, а биологическая классификация тесно связана с понятием пищевой ценности белков и представляет собой деление протеиногенных аминокислот на группы, различающиеся возможностью их биосинтеза в организме животных и человека.

 

1.6.1.                                                                                              Химическая классификация

  1. Простейшие аминокислоты
  2. Глицин, или гликокол (аминоуксусная кислота), сокращённые обо- значения — Гли, Gly, G:

Н2N – СН – СООН

| Н

 

Глицин был открыт в 1820 г. французским химиком А. Браконно среди продуктов гидролиза желатина. Это простейшая протеиногенная аминокис- лота, не имеющая оптических изомеров. Своё название гликокол (греч. “γλυκύς” — сладкий + “κόλλα” — клей), или глицин, аминоуксусная кислота получила за сладкий вкус.

  1. Аланин (α-аминопропионовая кислота), сокращённые обозначения
  • — Ала, Ala, A:

 

Н2N – СН – СООН

| СН3

 

Аланин сначала (1850 г.) был синтезирован немецким химиком А. Ф. Л. Штреккером, разработавшим способ получения α-аминокислот из альдегидов или кетонов действием NH3 и HCN с последующим гидролизом образую- щихся α-аминонитрилов (реакция Штреккера). Обработав продукт взаимо- действия уксусного альдегида с аммиаком синильной и соляной кислотами, он получил аланин. Наименование этой аминокислоты Штреккер произвёл от термина альдегид, отразив в нём название одного из исходных реактивов.

В составе белка аланин впервые обнаружил немецкий химик Т. Вейль в 1888 г. при изучении продуктов гидролиза фиброина шёлка.

II.    Гидроксиаминокислоты

  1. Серин (α-амино-β-гидроксипропионовая кислота), сокращённые обозначения — Сер, Ser, S:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

| ОН

 

Серин (греч. “σηρικόν” — шёлк) был впервые выделен немецким хи- миком Э. Крамером из серицина шёлка в 1865 г.

  1. Треонин (α-амино-β-гидроксимасляная кислота), сокращённые обо- значения — Тре, Thr, T:

 

Н2N –*СН – СООН

|

*СН – ОН

| СН3

Молекула треонина содержит два асимметрических атома углерода (*С). Поэтому для него возможно существование четырёх оптических изоме- ров.

Эта аминокислота получила своё название из-за структурного сходства с моносахаридом треозой.

Впервые треонин обнаружили в 1921 г. российские учёные Н. Д. Зе- линский и В. С. Садиков в кератине гусиного пера.

III.    Серосодержащие аминокислоты

  1. Цистеин (α-амино-β-меркаптопропионовая кислота), сокращённые обозначения — Цис, Cys, C:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

|

SН         сульфгидрильная группа

 

Характерной  химической  особенностью цистеина  является  наличие в

его молекуле сульфгидрильной группы (–SH), обладающей высокой реакци- онной способностью.  Эта группа может легко окисляться в живой  клетке,  и

 

тогда две молекулы цистеина образуют дисульфидную связь (–S–S–) и пре- вращаются в аминокислоту цистин (β,β′-дитиобис-(α-аминопропионовая ки- слота)), не входящую в число 20 протеиногенных:

 

H2N – CH – COOH     +      H2N – CH – COOH                  – 2H

|                                            |

CH2 – SH                 HS – H2C                                    + 2H

Цистеин                               Цистеин

 

H2N – CH – COOH          H2N – CH – COOH

|                                         |

CH2 – S                   S – H2C

Цистин

 

Так как в данной реакции принимает участие только SH-группа цис- теина, его формулу можно обозначить в упрощённом виде как Ц – SH, и то- гда упрощённая запись этой реакции будет выглядеть следующим образом:

 

– 2Н

Ц – SH     +     HS – Ц                              Ц – S – S – Ц

+ 2H

Цистеин           Цистеин                                  Цистин

 

Реакция превращения цистеина (восстановленная форма) в цистин (окисленная форма) — один из примеров реакций биологического окисле- ния, особенность которого состоит в том, что оно не связано с кислородом, а сопряжено с переносом водорода. Такой тип окисления наиболее широко распространён в живой природе. Эта реакция легко обратима, и окислитель- но-восстановительный процесс взаимопревращения этих аминокислот друг в друга играет важную роль в регуляции процессов обмена веществ.

В 1810 г. английским учёным У. Х. Волластоном впервые был выделен цистин из камней мочевого пузыря (греч. “κύστις” — пузырь). Однако то, что эта аминокислота является компонентом белков, было установлено лишь в 1899 г., когда шведский учёный К. А. Г. Мёрнер выделил цистин из продук-

 

тов гидролиза коровьего рога. В 1901 г. немецкий биохимик Г. Г. Эмбден впервые выделил из яичного белка цистеин.

  1. Метионин (α-амино-γ-метилтиомасляная кислота), сокращённые обозначения — Мет, Met, M:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

| СН2

| S

| CH3

 

Метионин впервые был обнаружен в 1922 г. американским исследова- телем Д. Г. Мёллером в казеине. В тривиальном названии этой аминокислоты отражено её научное наименование.

IV.   Аминокислоты с разветвлённым углеводородным радикалом

  1. Валин (α-аминоизовалериановая кислота), сокращённые обозначе- ния — Вал, Val, V:

 

Н2N – СН – СООН

| СН

 

Н3С        СН3

 

Валин в составе белка впервые был найден французским химиком П. Шютценберже в 1879 г. при исследовании продуктов гидролиза альбумина и получил своё название как производное валериановой кислоты.

  1. Лейцин (α-аминоизокапроновая кислота), сокращённые обозначения
  • — Лей, Leu, L:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

|  СН

 

Н3С        СН3

 

Первоначально (в 1819 г.) лейцин был открыт французским химиком Ж. Л. Прустом в неочищенном виде в гниющем сыре, а в 1820 г. А. Браконно выделил эту аминокислоту в кристаллической форме из продуктов гидролиза белков шерсти и мышц и назвал её лейцином по причине белого цвета (греч. “λευκός” — белый).

  1. Изолейцин (α-амино-β-метилвалериановая кислота), сокращённые обозначения — Иле, Ile, I:

 

Н2N – *СН – СООН

|

*СН

 

Н3С       СН2

| CH3

 

Молекула изолейцина содержит два асимметрических атома углерода (*С), и для неё, так же как и для молекулы треонина, возможно существова- ние четырёх оптических изомеров.

Изолейцин был впервые обнаружен в 1904 г. немецким химиком Ф. Эрлихом в продуктах гидролиза фибрина крови. Эта аминокислота получила такое название потому, что является изомером лейцина.

V.   Аминокислоты, содержащие ароматическое ядро

  1. Фенилаланин (α-амино-β-фенилпропионовая кислота), сокращён- ные обозначения — Фен, Phe, F:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

 

 

Фенилаланин был впервые найден в 1879 г. в побегах люпина и в 1881 г. выделен из продуктов гидролиза растительных белков швейцарскими био- химиками Э. Шульце и И. Барбьери.

Эта аминокислота получила своё название как производное аланина.

  1. Тирозин (α-амино-β-(n-гидроксифенил)-пропионовая кислота), со- кращённые обозначения — Тир, Tyr, Y:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

 

ОН

 

Тирозин (греч. “τυρός” — сыр) впервые был получен в 1846 г. немец- ким химиком Ю. Либихом из казеина сыра.

  1. Триптофан (α-амино-β-(3-индолил)-пропионовая кислота), сокра- щённые обозначения — Три, Trp, W:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

H

 

Триптофан — гетероциклическая аминокислота, т. к. в состав его ради- кала входит гетероцикл индол.

Впервые триптофан был выделен в 1901 г. английскими химиками Ф. Г. Гопкинсом и С. У. Колем из казеина. Однако задолго до этого учёным бы- ло известно, что белки дают цветные реакции, характерные для индольных группировок. Так, в 1890 г. немецкий химик Р. Неймайстер наблюдал появ- ление характерного для индола и его производных красного окрашивания при обработке продуктов гидролиза белков азотной кислотой (содержащей нитрит натрия). Неизвестное соединение, дающее красную окраску, Неймай- стер назвал триптофаном по наименованию фермента трипсина, с помощью которого он проводил расщепление белков.

VI.   Иминокислота

  1. Пролин (пирролидин-α-карбоновая кислота), сокращённые обозна- чения — Про, Pro, P:

 

 

HN – CH – COOH

|      |

H2C    CH2                       или

CH2

 

 

СООН

 
   

H

 

 

Пролин представляет собой гетероциклическое соединение — произ- водное пирролидина. Он отличается от всех остальных протеиногенных ами- нокислот тем, что содержит не аминную (–NH2), а иминную (   NH) группу,  т. е. является не аминокислотой, а иминокислотой. При взаимодействии с нингидрином пролин образует соединение жёлтого цвета.

Пролин был открыт немецким химиком Г. Э. Фишером в 1901 г. при изучении продуктов гидролиза казеина и получил тривиальное название по своему научному наименованию.

VII.    Основные аминокислоты

Все рассмотренные выше протеиногенные аминокислоты имеют одну карбоксильную и одну аминную группы, а их боковые радикалы ионогенных

 

групп не содержат. Поэтому при физиологических значениях pH среды сум- марный заряд молекул этих аминокислот равен нулю.

Однако среди протеиногенных аминокислот есть такие, у которых бо- ковые радикалы содержат химические группы, имеющие в нейтральной сре- де какой-либо заряд.

У основных аминокислот за счёт ионизации присутствующих в их бо- ковых радикалах основных группировок суммарный положительный заряд преобладает над отрицательным, и, следовательно, в целом молекулы этих аминокислот в водном растворе заряжены положительно. Протеиногенными аминокислотами, у которых преобладают основные свойства, являются гис- тидин, лизин и аргинин.

  1. Гистидин (α-амино-β-(4-имидазолил)-пропионовая кислота), со- кращённые обозначения — Гис, His, H:

 

Н2N – СН – СООН                        +Н3N – СН – СОО

|                                                        |

 

СН2

 

 

+ Н+

 

СН2

 

 

  • N NH – Н+             +НN      NH

 

В состав бокового радикала гистидина входит гетероцикл имидазол. Наряду с триптофаном и пролином, гистидин также является гетероцикличе- ским соединением. Азот имидазола сообщает гетероциклу основные свойст- ва.

Гистидин (греч. “ίστός” — ткань) был открыт немецким физиологом и биохимиком А. Косселем в 1896 г. Сначала он выделил из хроматина (веще- ства хромосом) разных тканей белок со щелочной реакцией, получивший на- звание «гистон», а затем из продуктов гидролиза гистона молок осетра — стурина он выделил гистидин. В том же году независимо от Косселя эту ами- нокислоту выделил из казеина шведский химик и физиолог С. Г. Хедин.

 

  1. Лизин (α,ε-диаминокапроновая кислота), сокращённые обозначения
  • — Лиз, Lys, K:

 

Н2N – СН – СООН                          +Н3N – СН – СОО

|                                                                        |

СН2                                                   СН2

|                                                                        |

СН2                     + Н+                       СН2

|                                                                         |

СН2                      – Н+                       СН2

|                                                                         |

CH2                                                     CH2

|                                                                         |

NH2                                                    NH3+

 

Радикал лизина, содержащий аминогруппу, проявляет свойства осно- вания при её ионизации.

Лизин (греч. “λύσις” — растворение) получил своё название из-за очень хорошей растворимости в воде. Впервые он был выделен из казеина немецким химиком Г. Ф. Э. Дрекселем в 1889 г.

  1. Аргинин (α-амино-δ-гуанидинвалериановая кислота), сокращённые обозначения — Арг, Arg, R:

 

Н2N – СН – СООН                       +Н3N – СН – СОО

|                                                                     |

СН2                                                 СН2

|                              + Н+                        |

СН2                                                 СН2

|                              – Н+                        |

СН2                                                 СН2

|                NH                                      |               NH2+ HN – С                                                   HN – С

NH2                                                 NH2

 

Основные свойства аргинина обусловлены наличием в его радикале гуанидиновой группировки, способной присоединять ион водорода.

Эту аминокислоту впервые выделили в 1886 г. Э. Шульце и Э. Штайгер из проростков люпина. А 1895 г. С. Г. Хедин получил аргинин (лат. “argen-

 

tum” — серебро) из продуктов гидролиза кератина рога в виде азотносереб- ряной соли.

VIII.     Кислые аминокислоты

Кислыми протеиногенными аминокислотами являются дикарбоновые аминокислоты. Они содержат в боковом радикале карбоксильную группу, которая в водном растворе диссоциирует и приобретает отрицательный за- ряд. У этих аминокислот суммарный отрицательный заряд преобладает над положительным, и, следовательно, в целом их молекулы при физиологиче- ских значениях рН среды заряжены отрицательно. Протеиногенными амино- кислотами, у которых преобладают кислые свойства, являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

  1. Аспарагиновая кислота (аминоянтарная кислота), сокращённые обозначения — Асп, Asp, D:

 

Н2N – СН – СООН                      +Н3N – СН – СОО

|                       + ОН                     |

СН2                                                СН2              +   Н2О

|                        – ОН                    |

СООН                                            СОО

 

Аспарагиновая кислота сначала была получена как продукт гидролиза аспарагина. В 1868 г. немецкий химик Г. Риттхаузен впервые выделил её из растительного белка.

  1. Глутаминовая кислота (α-аминоглутаровая кислота), сокращён- ные обозначения — Глу, Glu, E:

 

Н2N – СН – СООН                      +Н3N – СН – СОО

|                       + ОН                     |

СН2                                                СН2              +   Н2О

|                        – ОН                    |

СН2                                                СН2

|                                                       |

СООН                                            СОО

 

Глутаминовая кислота (лат. “gluten” — клей) была впервые выделена Г. Риттхаузеном в 1866 г. из продуктов гидролиза клейковинных белков зер- на пшеницы.

IX.   Амиды кислых аминокислот

В белках присутствуют амиды кислых аминокислот (в карбоксильной группе их бокового радикала гидроксильная группа замещена на аминогруп- пу). Амидные группировки в обычных условиях не диссоциируют. Суммар- ный заряд молекул амидов кислых аминокислот в водном растворе равен ну- лю.

  1. Аспарагин (β-амид аминоянтарной кислоты), сокращённые обозна- чения — Асн, Asn, N:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

|    О

С – NH2

 

Аспарагин впервые обнаружили французские химики Л. Н. Воклен и П. Ж. Робике в соке спаржи (аспарагуса) в 1806 г., что и отражено в его назва- нии. Наличие аспарагина в белках доказал индийский биохимик М. Дамода- ран в 1932 г., выделив его из эдестина — белка плодов конопли.

  1. Глутамин (γ-амид α-аминоглутаровой кислоты), сокращённые обо- значения — Глн, Gln, Q:

 

Н2N – СН – СООН

| СН2

| СН2

|    О

С – NH2

 

Наличие глутамина в белках доказал М. Дамодаран в 1932 г., выделив его из эдестина.

 

1.6.2.   Физико-химическая классификация

Протеиногенные аминокислоты классифицируют также на основе спо- собности их боковых радикалов смачиваться водой. Полярные и ионизиро- ванные радикалы обладают хорошей смачиваемостью водой, т. е. являются гидрофильными, а неполярные — стремятся контакта с водой избежать, т.  е. являются гидрофобными.

К аминокислотам с неполярными радикалами относятся аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, пролин и метионин. Радикалы этих аминокислот построены преимущественно из углеводородных групп, характеризующихся равномерным распределением электронной плотности. Что касается присутствующего в радикале метионина атома серы, то он на- ходится в окружении углеводородных групп и поэтому не проявляет своих электроотрицательных свойств. По этой же причине не проявляет электроот- рицательных свойств и содержащийся в радикале триптофана атом азота.

Протеиногенными аминокислотами с полярными радикалами являются серин, треонин, тирозин, цистеин, аспарагин и глутамин. В их составе содер- жатся полярные группы (гидроксильная, сульфгидрильная, амидная), харак- теризующиеся неравномерным распределением электронной плотности. Ио- низирующимися радикалами обладают лизин, аргинин, гистидин, аспараги- новая и глутаминовая кислоты. Радикалы всех этих аминокислот являются гидрофильными (в большей или меньшей степени), так как взаимодействуют с молекулами воды, обладающими сильным дипольным моментом.

С разнообразием радикалов аминокислот по химической природе и фи- зическим свойствам (в т. ч. длина радикала, его объём) тесно связаны поли- функциональность и специфические особенности белковых тел.

 

1.7.   Отдельные функции аминокислот

Основная функция протеиногенных аминокислот заключается в по- строении белковых молекул в клетках живых организмов. Однако большая группа аминокислот (непротеиногенные) не участвуют в построении белко-

 

вых молекул и могут являться структурными элементами других важных природных соединений. Например, непротеиногенная аминокислота β-ала- нин входит в состав пантотеновой кислоты — витамина, играющего исклю- чительно важную роль в обеспечении протекания реакций взаимопревраще- ний углеводов и жиров:

 

β        α

H2N – СН2 – СН2 – СООН

β-Аланин

 

Отдельные аминокислоты выполняют также целый ряд специфических функций.

Цистеин, например, обладает радиозащитным свойством. При введении цистеина в организм до облучения он снижает степень поражения человека или животного ионизирующим излучением. Вещества, обладающие таким свойством, называют радиопротекторами (лат. “radiare” — излучать + “protector” — защитник).

Некоторые аминокислоты оказывают воздействие на передачу нервных импульсов от одной нервной клетки к другой, т. е. выполняют функцию ней- ромедиаторов (греч. “νεΰρον” — нерв + лат. “mediator” — посредник). На- пример, аспарагиновая и глутаминовая кислоты являются возбуждающими, а глицин и непротеиногенная γ-аминомасляная кислота — тормозящими ней- ромедиаторами центральной нервной системы:

 

γ        β         α

NH2 – СН2 – СН2 – СН2 – СООН

γ-Аминомасляная кислота

 

Препараты этих аминокислот применяют при лечении заболеваний центральной нервной системы.

При окислении тирозина образуются меланины (греч. “μέλας” — чёр- ный) — чёрные или тёмно-коричневые пигменты, ответственные за окраску шерсти животных, оперения птиц, цвет кожи, радужной оболочки глаз, волос

 

человека, родинок. Очень активно эти пигменты вырабатываются в организ- ме, когда мы загораем. Образование меланинов происходит и при изготовле- нии некоторых пищевых продуктов, например ржаного хлеба, макарон, что приводит к их потемнению. Меланины содержатся в лузге плодов подсол- нечника, головневых грибах и т. д.

Аминокислоты могут вступать в реакцию с восстанавливающими саха- рами. В ходе реакции выделяются углекислый газ и аммиак, аминокислота превращается в соответствующий альдегид, а сахар — в фурфурол или окси- метилфурфурол. Образующиеся альдегиды обладают различными запахами, которые обуславливают специфический аромат и, отчасти, вкус того или иного пищевого продукта. Фурфурол и оксиметилфурфурол вступают в ре- акции с аминокислотами, приводя к образованию тёмноокрашенных продук- тов — меланоидинов (греч. “μέλας” — чёрный + “εἶδος” — вид). Эти реак- ции протекают при повышенных температурах, например при выпечке хлеба, сушке макарон, жарке овощей, рыбы, мяса и др., придавая продуктам харак- терную коричневую окраску. Таким образом, меланоидины содержатся в ап- петитной корочке хлеба, румяной корочке шашлыка, жареной рыбе, ряженке, солоде, пиве, вине, пряниках и т. д.

Некоторые аминокислоты, такие как глицин, аланин, серин, пролин и др. обладают сладким вкусом и могут найти применение как заменители са- хара, что актуально для больных сахарным диабетом. L-Глутаминовая кисло- та имеет характерный вкус мяса; её натриевая соль (глутамат натрия) широко применяется в качестве вкусовой добавки. Она придаёт блюдам вкус кури- ного бульона и создаёт ощущение сытости.

 

1.8.   Пищевая и биологическая ценность белков

Белки животного и растительного происхождения, поступающие с пи- щей, распадаются в организме человека и животных до аминокислот, из ко- торых затем строятся новые белки, присущие данному организму. Таким об-

 

разом, основная функция белков в питании — снабжение человеческого и животного организма необходимым количеством аминокислот.

При этом 12 из 20 протеиногенных аминокислот могут образовываться в организме человека и животных также в ходе реакций вторичного синтеза, т. е. из органических предшественников, в том числе путём превращений од- них аминокислот в другие. Согласно биологической классификации эти ами- нокислоты называют заменимыми.

Однако восемь протеиногенных аминокислот — лизин, триптофан, ме- тионин, фенилаланин, валин, лейцин, изолейцин и треонин — не могут син- тезироваться в организме человека и животных. Они являются незамени- мыми в пищевом отношении, и поэтому для построения собственных белков человек и животные должны регулярно потреблять в составе пищевых про- дуктов белки, содержащие все незаменимые аминокислоты.

В растениях все 20 протеиногенных аминокислот могут образовывать- ся из простейших неорганических соединений — углекислого газа, воды, ам- миака и нитратов, т. е. в ходе реакций первичного синтеза. Поэтому для рас- тений незаменимых аминокислот не существует.

Однако прежде чем попасть в организм человека синтезированные рас- тениями аминокислоты проходят длинный путь по трофическим (греч. “τρωφη” — питание) цепям (рис. 3).

 

 

СО2, Н2О, NH3, NO3

 

Аминокислоты

Белки человека

 
   

Аминокислоты            Белки плотоядных

 

Белки растений                                                       животных

                                 Белки растительно-                         Аминокислоты                                    ядных животных              Аминокислоты

 

 

Рис. 3. Движение аминокислот по трофическим цепям

 

Потребляемые человеком белки, различаются по аминокислотному со- ставу, содержанию незаменимых аминокислот и, следовательно, по пищевой ценности.

Белки, которые содержат все восемь незаменимых аминокислот в ко- личествах, достаточных для удовлетворения пластических потребностей в них организма, называют полноценными. Если хотя бы одна из восьми не- заменимых аминокислот в белке отсутствует или содержится в недостаточ- ном для удовлетворения этих потребностей количестве, то такой белок счи- тается неполноценным в пищевом отношении. Неполноценным белком, на- пример, является зеин кукурузы, т. к. он совсем не содержит лизина и почти не содержит триптофана.

В случае отсутствия в белке пищи какой-либо заменимой аминокисло- ты, клетки организма могут синтезировать её из других веществ и тем самым поддерживать полный набор аминокислот, необходимых для синтеза белков. Если же в белке пищи отсутствует хотя бы одна из незаменимых аминокис- лот, то синтез белков в организме прекращается, так как в построении подав- ляющего большинства природных белков участвуют все 20 протеиногенных аминокислот.

Поэтому питание неполноценными белками приводит к смертельно опасным нарушениям в обмене веществ. Так, например, нехватка нужного набора аминокислот в кормах животных приводит к атрофии мышц, падению привесов и может привести к их гибели. У людей в результате питания не- полноценными белками возникают различные формы идиопатии, недоразви- тия, истощения, и также может наступить смерть.

Как правило, полноценными являются животные белки, а растительные белки в основном неполноценные.

Это связано с тем, что растительные и животные белки резко различа- ются по аминокислотному составу. В растительных белках, как правило, не хватает лизина, треонина и триптофана, и поэтому они являются неполно- ценными, хотя в растениях обычно содержится достаточное для питания че-

 

ловека количество белков. Аминокислотный состав белков животного проис- хождения ближе к аминокислотному составу белков человека. Включение их в рацион удовлетворяет потребность человека во всех незаменимых амино- кислотах; поэтому они относятся к полноценным белкам.

Высокой пищевой ценностью отличаются белки мясных и молочных продуктов. Из растительных белков хорошо сбалансированы по аминокис- лотному составу белки семян бобовых культур. В них содержатся почти все незаменимые аминокислоты в достаточном количестве для удовлетворения потребностей человека и, в первую очередь, такие дефицитные, как лизин, триптофан и треонин. Однако белки семян бобовых обеднены серосодержа- щими аминокислотами. В составе белков плодов злаковых культур, напро- тив, часто не хватает лизина, треонина и триптофана, но содержится доста- точное для питания человека количество серосодержащих аминокислот. Пи- щевые белки бобовых и злаков хорошо дополняют друг друга и в смеси при- ближаются к полноценным животным белкам.

Таким образом, проблема обеспечения населения пищевым белком связана не только с количеством потребляемого белка, но и с его качеством, которое определяется аминокислотным составом белка.

Пищевая ценность белка определяется не только наличием в нём всех незаменимых аминокислот. Белок будет полноценным, если все аминокисло- ты в нём представлены в оптимальном для нормальной жизнедеятельности организма количестве и соотношении. Другими словами в белке пищи дол- жен быть сбалансирован не только состав незаменимых аминокислот, но и должно быть определённое соотношение незаменимых и заменимых амино- кислот, в противном случае часть незаменимых аминокислот будет расходо- ваться не по назначению.

Прежде всего, надо учитывать, что такие заменимые аминокислоты как цистеин и тирозин синтезируются в организме человека из незаменимых аминокислот — метионина и фенилаланина соответственно. Поэтому при недостаточном содержании в потребляемом белке цистеина и тирозина по-

 

требность организма в метионине и фенилаланине увеличивается, а при дос- таточном содержании — значительно уменьшается. Цистеин и тирозин отно- сят к условно заменимым аминокислотам, т. е. к заменимым аминокислотам при условии достаточного поступления с пищей метионина и фенилаланина.

Кроме этого, такие аминокислоты, как аргинин и гистидин синтезиру- ются в организме человека в недостаточном количестве. Для полного обеспе- чения потребности организма в этих аминокислотах с пищей должны посту- пать, особенно в детском возрасте, дополнительные количества этих амино- кислот. Аргинин и гистидин — частично заменимые аминокислоты.

Также, при некоторых, чаще всего врождённых, заболеваниях перечень незаменимых аминокислот может расширяться. Например, в организме лю- дей, страдающих фенилкетонурией, реакция превращения фенилаланина в тирозин не протекает. Заболевание проявляется в нарушении развития мозга у новорождённых и, как следствие, умственной отсталости. Для таких людей тирозин является незаменимой аминокислотой, и продукты с высоким со- держанием фенилаланина из их рациона следует исключить.

Таким образом, на величины потребностей организма в определённых аминокислотах сильно влияет общий аминокислотный состав белков.

Для характеристики пищевой ценности белка чаще всего пользуются специальным показателем — аминокислотным скором (англ. “score” — счёт), который рассчитывают по формуле:

X

Аминокислотный скор =           · 100 %,

A

 

где X — количество миллиграммов аминокислоты, содержащееся в 1 грамме исследуемого белка; A — количество миллиграммов этой же аминокислоты, содержащееся в 1 грамме эталонного белка.

Эталонный белок представляет собой теоретический белок, идеально сбалансированный по аминокислотному составу. Содержание незаменимых аминокислот в 1 грамме идеального в пищевом отношении белка было опре-

 

делено экспертами ФАО (англ. “FAO, Food and Agriculture Organization” — Продовольственная и сельскохозяйственная организация при ООН) и ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) в 1973 г. и уточнено в 1985 г.

Скор всех аминокислот в эталонном белке составляет 100 %. Любой исследуемый белок сравнивают с оптимальным для питания человека эта- лонным белком по каждой аминокислоте. Скор аминокислот исследуемого белка может быть больше, меньше или равен 100 %. В случае если амино- кислотный скор превышает 100 %, это означает, что данная аминокислота находится в избытке по сравнению с её оптимальным содержанием. Если аминокислотный скор равен 100 %, это означает, что содержание данной аминокислоты в исследуемом белке оптимально для питания человека. И, наконец, если аминокислотный скор меньше 100 %, то данной аминокислоты в пищевом отношении недостаёт. Близкой к эталону является смесь белков пшеницы и молока (табл. 2).

Таблица 2 Пищевая ценность белков коровьего молока и зерна пшеницы

 

Аминокислота

Эталонный белок,

мг ам-ты

 

1 г белка

Белок коровьего

молока

Белок зерна

пшеницы

мг ам-ты

 

1 г белка

скор

мг ам-ты

 

1 г белка

скор

Изолейцин

40

47

117

35

87

Лейцин

70

95

136

72

103

Лизин

55

78

142

31

56

Метионин + цистеин

35

33

94

43

123

Фенилаланин + тирозин

60

102

170

81

135

Треонин

40

44

110

31

77

Триптофан

10

14

140

12

120

Валин

50

64

128

47

94

 

Поскольку неточность определения количества аминокислот в белке составляет 5 %, полноценными считают белки тех продуктов, в которых скор

 

каждой из незаменимых аминокислот равен 95 % и больше. При этом содер- жание метионина и цистеина, а также фенилаланина и тирозина определяется в сумме, т. к. организм человека из метионина может получать цистеин, а из фенилаланина — тирозин.

Из таблицы 2 видно, что белок коровьего молока имеет высокую пище- вую ценность, однако количество серосодержащих аминокислот в нём явля- ется недостаточным. Пищевая ценность белка зерна пшеницы значительно ниже, в нём в недостаточном количестве содержатся четыре аминокислоты: лизин, треонин, изолейцин и валин. Самый низкий скор у лизина — 56 %.

Аминокислоту, обладающую самым низким скором в исследуемом белке, называют лимитирующей (лат. “limitis” — граница). Она определяет степень усвоения всего белка. Это связано с тем, что аминокислоты, посту- пающие в организм с пищей в избытке относительно лимитирующей, не ис- пользуются на биосинтез белков и не запасаются впрок. Они быстро распа- даются в процессе обмена веществ и выводятся из организма. Все аминокис- лоты, требуемые для биосинтеза белков, должны присутствовать в клетке одновременно и в доступной форме.

Белки различаются не только по пищевой ценности, но и по степени усвоения, т. е. имеют различную биологическую ценность. Животные белки усваиваются человеком более чем на 90 %, а растительные — на 60–80 %; следовательно, биологическая ценность животных белков выше, чем расти- тельных. Это объясняется тем, что к белкам человека гораздо ближе по ами- нокислотному составу белки животных, чем белки растений. Кроме того, ус- воение растительных белков снижено из-за присутствия в клетках растений целлюлозы — неусвояемого полисахарида, мешающего более полному ус- воению белков. Усиливая перистальтику кишечника, целлюлоза способству- ет более быстрому выведению аминокислот из организма, которые не всасы- ваются. Установлено, что на биосинтез 1 кг животного белка расходуется 6–8 кг растительного. Тепловая обработка способствует более полному усвоению белков организмом.

 

Согласно рекомендациям ФАО и ВОЗ суточная норма потребления белка для взрослого человека составляет 80–100 г, или 1–1,5 г на 1 кг массы тела. Для детей эта норма выше — 1,5–4 г на 1 кг массы тела, что связано с интенсивным протеканием в детском организме синтетических процессов и расходованием белков на пластические нужды. Потребность организма в белках также возрастает при интенсивной физической нагрузке, инфекцион- ных заболеваниях, беременности и др.

В настоящее время на Земле ощущается общий дефицит незаменимых аминокислот. Связано это с тем, что 80 % пищевого белка на Земле содер- жится в растениях и только 20 % белков — животного происхождения, тогда как идеальным считается присутствие в рационе 45 % растительных и 55 % животных белков.

Из всего вышеизложенного становится понятно, что белок — один из важнейших компонентов продуктов питания — наиболее дефицитное пище- вое вещество на Земле, а его биологическая ценность — важная проблема с точки зрения полноценного питания человека.

По данным специалистов из ООН уже сегодня 10–15 % жителей Земли голодает, а 40 % получает неполноценную и недостаточную по белку пищу. В первую очередь это касается экономически слабо развитых стран, где ос- нову рациона составляют растительные продукты. Содержание в них белков, а главное, содержание незаменимых аминокислот в белках меньше, чем в мясных продуктах. В результате возникает белковая недостаточность, ко- торая особенно тяжело проявляется в детском возрасте. Болезнь, вызванная белковой недостаточностью у детей, получила название квашиоркор. При квашиоркоре наблюдается задержка роста, малокровие, поражение почек и печени. Квашиоркор — одна из основных причин детской смертности в сла- боразвитых странах мира. В связи с быстрым ростом численности населения Земли проблема белковой недостаточности становится всё более острой.

Для решения этой глобальной проблемы применяются меры, направ- ленные на увеличение производства полноценного белка. Во-первых, это по-

 

вышение продуктивности растениеводства и животноводства, т. е. увеличе- ние урожайности сельскохозяйственных культур, увеличение производства мяса и молока, а также селекция сельскохозяйственных культур на амино- кислотный состав. Во-вторых, это развитие индустриального производства белков, которое осуществляется сейчас тремя способами: производством кормовых дрожжей, приготовлением белково-витаминных концентратов и выделением белков из непищевого сырья растительного происхождения. В- третьих, это производство незаменимых аминокислот, совершенствование технологии хранения и переработки пищевого сырья с целью минимизации потерь белков и др.

Наконец, следует помнить, что в продуктах питания содержатся три основных пищевых вещества: белки, жиры и углеводы. Углеводы и жиры, являющиеся в основном поставщиками энергии, взаимозаменяемы, то есть легко превращаются друг в друга. Белки же в тканях человека не откладыва- ются про запас, и поэтому необходимо ежедневное поступление их с пищей для восполнения пластических и энергетических затрат, построения и возоб- новления тканей организма. Вот почему именно белки пищи в значительной степени влияют на здоровье и продолжительность жизни человека.

 

1.9.   Пептиды и их функции

α-Карбоксильная группа одной α-аминокислоты и α-аминная группа другой α-аминокислоты могут взаимодействовать друг с другом. При этом от карбоксильной группы отщепляется ОН-группа, а от аминной группы — атом водорода. В результате выделяется молекула воды, а остатки двух α-аминокислот соединяются между собой связью –CO–NH–:

 

 

O

 

O      Н                    O

 

||

O

Н2N–CH–C         +      N–CH–C

|           OH   Н        |            OH R1                            R2

Аминокислота 1    Аминокислота 2

 

– H2O

Н2N–CH–C–N–CH–C

|           |    |

R1       H R2

Дипептид

 

OH

 

Группа –CО–NН– называется пептидной группой, а связь между ато- мами углерода и азота в пептидной группе — пептидной связью.

Продукт реакции, образовавшийся из остатков двух аминокислот, на- зывается дипептидом. Присутствующие на его концах свободные α-аминная и α-карбоксильная группы способны образовывать новые пептидные связи с другими аминокислотами. После присоединения к дипептиду ещё одной аминокислоты образуется трипептид. Когда аминокислота присоединяется к трипептиду, образуется тетрапептид. Если к тетрапептиду добавить ещё од- ну аминокислоту, получается пентапептид. Взаимодействие аминокислоты с пентапептидом даёт гексапептид и т. д. Пептиды, содержащие от 2 до 10 аминокислотных остатков, называют олигопептидами, а содержащие более 10 аминокислотных остатков — полипептидами.

В пептидах аминокислотный остаток, содержащий свободную α-ами- ногруппу, называется N-концевым, или аминоконцевым, а содержащий сво- бодную α-карбоксильную группу — С-концевым, или карбоксиконцевым. N-концевой аминокислотный остаток считается началом молекулы пептида, а С-концевой — её окончанием. Поэтому формулы пептидов следует писать, начиная с N-концевого аминокислотного остатка.

Пептиды имеют как традиционные наименования, так и номенклатур- ные названия, отражающие их структуру. Номенклатурные названия образу- ются в результате последовательного перечисления тривиальных названий всех входящих в состав пептида аминокислот, начиная с N-конца, с заменой их окончаний на «-ил», т. к. аминокислоты в составе пептидов находятся в форме ацилов. Название С-концевой аминокислоты остаётся без изменений.

Таким образом, получаются следующие названия аминокислотных ос- татков, составляющих пептиды: глицил, аланил, серил, треонил, цистеинил, метионил, валил, лейцил, изолейцил, фенилаланил, тирозил, триптофанил (триптофил), пролил, гистидил, лизил, аргинил. Поскольку у наименований аспарагиновой и глутаминовой кислот и их полуамидов одинаковые корни, остатки глутамина и аспарагина называют глутаминил и аспарагинил, а ос-

 

татки аспарагиновой и глутаминовой кислот — аспарагил (аспартил) и глу- тамил.

Например, тетрапептид из последовательно соединённых остатков аминокислот аланина, серина, тирозина и валина (Ала-Сер-Тир-Вал) называ- ется аланилсерилтирозилвалин.

Первые пептиды (греч. “πεπτος” — переваренный) были получены как промежуточные продукты гидролиза белков ферментом пепсином. Сам тер- мин был предложен Э. Г. Фишером в 1902 г. Окончание «-ид» указывает на то, что пептиды являются биополимерами, построенными из мономеров (та- кое же окончание имеет, например, термин «полисахариды»).

К настоящему времени в объектах живой природы найдено несколько сотен различных пептидов, многие из которых играют важную роль в про- цессах обмена веществ.

В 1921 г. английский биохимик Ф. Г. Гопкинс открыл трипептид глу- татион, состоящий из остатков трёх аминокислот — глутаминовой кислоты, цистеина и глицина:

 

HOOC–CH–CH2–CH2–CO–NH–CH–CO–NH–CH2–COOH

|                                     |

NH2                               CH2–SH

 

Номенклатурное название глутатиона — γ-глутамилцистеинилглицин, или γ-Глу-Цис-Гли. Греческая буква γ в названии указывает на особенность построения этого пептида, а именно на то, что аминогруппа цистеина в глу- татионе образует пептидную связь не с α-карбоксильной группой глутамино- вой кислоты, а с карбоксильной группой её радикала.

Глутатион имеет две формы — восстановленную и окисленную. В вос- становленной форме глутатион содержит свободную сульфгидрильную группу. Подобно превращению двух молекул цистеина в цистин две молеку- лы восстановленного глутатиона в результате окисления сульфгидрильных групп соединяются друг с другом дисульфидной связью, образуя окисленную

 

форму глутатиона. Поскольку в данной реакции принимает участие только сульфгидрильная группа глутатиона, а остальная часть его молекулы в пре- вращениях не участвует, для простоты восстановленный глутатион обозна- чают как Г–SH, а окисленный глутатион — как Г–S–S–Г. Тогда реакцию взаимопревращений двух форм глутатиона можно записать так:

 

– 2Н

Г–SH  +   НS–Г                      Г–S–S–Г

+ 2Н

 

Глутатион содержится во всех живых организмах. Он присутствует в дрожжах, зародыше зерна пшеницы, крови человека и животных и др. Ос- новными биологическими функциями глутатиона являются регуляция окис- лительно-восстановительных процессов в клетках, а также каталитической активности ряда ферментов.

Природные пептиды являются биологически активными соединениями. Они выполняют множество разнообразных биологических функций, напри- мер: участвуют в регуляции пищеварения (гастрин, секретин), мышечных со- кращениях (анзерин, карнозин). Среди пептидов встречаются гормоны (окси- тоцин, вазопрессин, глюкагон), нейропептиды (пептиды поведения, памяти, сна), яды (аманитины и фаллоидины бледной поганки и других мухоморов, апамин яда пчёл, конотоксин морских моллюсков), антибиотики (грамици- дин S) и др.

 

1.10.   Строение белковой молекулы

Белки представляют собой полипептиды, молекулярная масса которых превышает 6000–10000 дальтон. Таким образом, они являются высокомоле- кулярными соединениями, состоящими из большого числа аминокислотных остатков.

В отличие от низкомолекулярных пептидов, белки обладают хорошо развитой трёхмерной пространственной  структурой, которая стабилизирует-

ся  различного рода  взаимодействиями  — сильными и слабыми. Представ-

 

ление о многоуровневой пространственной организации белков впервые сформулировал датский биохимик К. У. Линдерстрём-Ланг в 1952 г. Разли- чают четыре уровня структурной организации белковых молекул: первич- ную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.

 

1.10.1.   Первичная структура белка

Первичная структура белка представляет собой последовательность аминокислотных остатков, соединённых друг с другом пептидными связями в полипептидную цепочку.

Впервые предположение о роли пептидных связей в построении белко- вых молекул было выдвинуто русским биохимиком А. Я. Данилевским (1888 г.), идеи которого легли в основу полипептидной теории строения белков, сформулированной немецким химиком Э. Г. Фишером в 1902 г. В общем ви- де полипептидная цепочка белковой молекулы выглядит так:

 

O

R2

Н

O

R4

Н

||

|

|

||

|

|

H2N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–L      L–N–CH–COOH

|           |           ||        |           |           ||                    |

R1       Н         O      R3       Н         O                   Rn

 

N-концевой аминокислотный остаток  C-концевой аминокислотный остаток

 

Основу первичной структуры белковой молекулы образует регулярно повторяющийся пептидный остов –NH–CH–CO–, а боковые радикалы ами- нокислот составляют её вариабельную часть.

Первичная структура белка прочная, т. к. в основе её построения лежат ковалентные по характеру пептидные связи, представляющие собой сильные взаимодействия.

Соединяясь между собой в различной последовательности, протеино- генные аминокислоты образуют изомеры. Из трёх аминокислот, меняя поря- док их расположения, можно построить шесть (3!) различных трипептидов.

 

Например, из глицина, аланина и валина — Гли-Ала-Вал, Гли-Вал-Ала, Ала- Гли-Вал, Ала-Вал-Гли, Вал-Гли-Ала и Вал-Ала-Гли. Из четырёх аминокис- лот можно образовать 24 (4!) тетрапептида, а из пяти — 120 (5!) пентапепти-

дов. Из 20 аминокислот можно построить 20!, т. е. 2 432 902 008 176 640 000 или ≈ 2·1018 полипептидов. При этом каждая аминокислота участвует в по- строении рассмотренных полипептидных цепочек только один раз.

Многие природные полипептиды насчитывают в своём составе сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, и каждая из 20 протеиногенных ами- нокислот может встречаться в их составе неоднократно. Поэтому число воз- можных вариантов полипептидных цепочек бесконечно велико. Однако в природе реализуются далеко не все теоретически возможные варианты ами- нокислотных последовательностей.

Первым белком, первичная структура которого была расшифрована, является бычий инсулин (рис. 4). Его молекула состоит из двух полипептид- ных цепочек: А-цепи, содержащей 21, и В-цепи, содержащей 30 аминокис- лотных остатков. Цепочки соединяются между собой двумя дисульфидными связями (мостиками). Ещё одна дисульфидная связь располагается внутри короткой цепи. Последовательность расположения аминокислотных остатков в молекуле инсулина установил английский биохимик Ф. Сэнгер в 1953 г.

 

1                                                                                                                                            21

|                       |

Цис-Ала-Сер-Вал

 

 

1

| S

|

 

Фен

|

S

|

 

 

 

Гли-Иле-Вал-Глу-Глн-Цис – S – S – Цис-Сер-Лей-Тир-Глн-Лей-Глу-Асн-Тир-Цис-Асн

S

| S

 

Вал-Асн-Глн-Гис-Лей-Цис-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Гли

| Ала-Лиз-Про-Тре-Тир-Фен-Фен-Гли-Арг-Глу 30

 

Работа Сэнгера, на которую ушло несколько лет, явилась переломным этапом в изучении белков. Расшифровав первичную структуру инсулина, он впервые подтвердил полипептидную теорию строения белковой молекулы Э. Г. Фишера и доказал, что белки — это химические соединения, обладающие строго определённой структурой, которую можно изобразить в виде химиче- ской формулы, показывающей порядок соединения аминокислот в полипеп- тидной цепочке.

Сэнгером впервые были разработаны принципы расшифровки первич- ной структуры белка, которые сегодня модифицированы и усовершенствова- ны.

Определение последовательности аминокислотных остатков в белке осуществляется в несколько этапов.

Сначала определяют аминокислотный состав полипептидной цепочки. С этой целью её подвергают полному кислотному гидролизу. Затем в полу- ченной смеси аминокислот, используя какой-либо метод хроматографическо- го анализа, проводят их количественное определение.

После этого приступают к идентификации N- и C-концевого аминокис- лотных остатков в белковой молекуле.

Для определения остатка N-концевой аминокислоты в полипептид- ной цепи его метят с помощью соединения, образующего с ним стабильную ковалентную связь. Для этой цели Сэнгер использовал 2,4-динитрофторбен- зол, который присоединяется в качестве метки к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка полипептидной цепи, в результате чего образуется 2,4-динитрофенильное производное полипептида:

 

O2N                     F +  H2N-CH-CO-NH-CH-CO-L L-NH-CH-COOH

|                   |                              |                 – HF NO2                      R1                R2                           Rn

2,4-Динитрофторбензол                      Полипептид

 

O2N

 

HN–CH–CO–NH–CH–CO–L L–NH–CH–COOH

|                     |                                |

NO2       R1                  R2                             Rn

2,4-Динитрофенильное производное полипептида

 

При последующем кислотном гидролизе все пептидные связи в белке расщепляются, а ковалентная связь между α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка и 2,4-динитрофторбензолом сохраняется:

 

O2N

 

  HN-CH-CO-NH-CH-CO-L  L-NH-CH-COOH

|                   |                              |

NO2    R1               R2                           Rn

2,4-Динитрофенилпроизводное полипептида

 

+ (n–1) Н2О;

 

Н+                                          

O2N                       HN–CH–COOH + Смесь свободных аминокислот

|

NO2       R1

2,4-Динитрофениламинокислота

 

Гидролизат содержит свободные аминокислоты и 2,4-динитрофениль- ное производное N-концевой аминокислоты, которое отличается жёлтой ок- раской и легко может быть выделено и идентифицировано методами хрома- тографического анализа.

Поскольку белковая молекула может содержать не одну, а несколько полипептидных цепочек, метод Сэнгера позволяет также установить количе- ство полипептидных цепей, из которых состоит исследуемый белок.

Однако данный метод определения остатка N-концевой аминокислоты в полипептиде имеет существенный недостаток: так как при гидролизе поли- пептидной цепочки происходит её полная деградация, то для дальнейших ис- следований необходима новая порция белка.

Поэтому более широкое распространение получил метод, разработан- ный шведским биохимиком П. В. Эдманом, создавшим вместе со своим кол- легой Г. С. Бэггом для определения чередования аминокислотных остатков в

 

полипептидах специальный автоматический прибор — секвенатор (англ. “se- quence” — последовательность).

Согласно методу Эдмана исследуемый полипептид обрабатывают спе- циальным реагентом — фенилизотиоцианатом, который присоединяется к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка с образованием фе- нилтиокарбамоилполипептида:

 

ОН

              N=C=S + H2N-CH-CO-NH-CH-CO-L L-NH-CH-COOH

|                   |                              |

R1                          R2                                             Rn

Фенилизотиоцианат                       Полипептид

 

NH      CO–NH–CH–CO–L L–NH–CH–COOH

|           |             |                                 |

S=C–NH–CH–R1  R2                              Rn

Фенилтиокарбамоилполипептид

 

При обработке полученного продукта реакции холодной разбавленной кислотой происходит образование и отщепление фенилтиогидантоинового производного остатка N-концевой аминокислоты. При этом исследуемый по- липептид укорачивается на один аминокислотный остаток:

 

H+

NH      CO–NH–CH–CO–L L–NH–CH–COOH

|           |             |                                 |

S=C–NH–CH–R1  R2                              Rn

Фенилтиокарбамоилполипептид

 

N         C=O    +     Н2N–CH–CO–L  L–NH–CH–COOH

|           |                           |                                 |

S=C–NH–CH–R1                R2                              Rn

Фенилтиогидантоиновое производное       Полипептид, укороченный аминокислотного остатка               на один аминокислотный остаток

 

Укороченный полипептид остаётся неповреждённым и со своим новым N-концевым аминокислотным остатком включается в аналогичные превра- щения в новом цикле. Последовательно отщепляющиеся N-концевые амино- кислотные остатки идентифицируют хроматографическим методом. Таким образом можно определить с N-конца последовательность приблизительно  50 аминокислотных остатков в полипептидной цепи.

Для определения остатка С-концевой аминокислоты исследуемый полипептид обрабатывают специальными ферментами (карбоксипептидаза- ми), которые последовательно отщепляют от него только С-концевые амино- кислоты. Отщеплённые аминокислоты идентифицируют хроматографиче- ским методом. Последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептиде с С-конца устанавливают, изучая кинетику их отщепления карбоксипептидазами.

Этим методом надежно удаётся определить последовательность распо- ложения около пяти аминокислотных остатков в С-конце полипептидной це- пи, т. к. при его расшифровке возникает ряд осложнений, например, когда встречаются несколько стоящих подряд остатков одной и той же аминокис- лоты и др.

На следующем этапе расшифровки первичной структуры белка опре- деляют последовательность аминокислотных остатков, располагающих- ся между N- и С-концевыми.

Для этого полипептидную цепь сначала подвергают ферментативному гидролизу, например с помощью фермента трипсина, который специфически разрывает эту цепь на короткие пептиды в очень небольшом количестве мест, а именно по пептидным связям, в образовании которых принимали участие карбоксильные группы остатка лизина или аргинина.

Затем полученные пептиды разделяют методами хроматографии и электрофореза и в каждом из них выясняют порядок чередования аминокис- лотных остатков (например, с помощью секвенатора).

 

После этого тот же белок подвергают гидролизу другим способом по другим участкам молекулы, например, с помощью бромциана (BrCN) — спе- циального химического реагента, расщепляющего лишь те пептидные связи, в образовании которых принимала участие карбоксильная группа остатка ме- тионина. В полученных пептидах также устанавливают аминокислотную по- следовательность.

Полученные две партии коротких пептидов (один пептид в среднем со- стоит из 10–15 аминокислотных остатков) являются взаимно перекрываю- щимися. Складывая полученные фрагменты так, чтобы перекрывающиеся участки совпадали, можно установить аминокислотную последовательность в целом белке.

Например, при гидролизе полипептидной цепи с помощью трипсина были получены следующие пептиды:

Гли-Лей-Тре-Мет-Гис-Фен-Лиз;  Иле-Глу-Ала-Мет-Вал-Арг;  Тир-Асп-Сер А при гидролизе этого же полипептида с помощью бромциана получи-

ли такие пептиды:

Гли-Лей-Тре-Мет; Гис-Фен-Лиз-Иле-Глу-Ала-Мет; Вал-Арг-Тир-Асп-Сер Тогда методом перекрывающихся пептидов может быть установлена

полная формула исходной белковой молекулы:

 

Гли-Лей-Тре-Мет

Гли-Лей-Тре-Мет-Гис-Фен-Лиз

Гис-Фен-Лиз-Иле-Глу-Ала-Мет

Иле-Глу-Ала-Мет-Вал-Арг

Вал-Арг-Тир-Асп-Сер

Тир-Асп-Сер

 

К настоящему времени расшифрованы первичные структуры несколь- ких тысяч различных белков и пептидов.

Химическая природа каждого белка уникальна и тесно связана с его биологической функцией. Способность белка выполнять присущую ему функцию определяется его первичной структурой. Даже небольшие измене- ния в последовательности аминокислот в белке могут привести к серьёзному нарушению в его функционировании, возникновении тяжёлого заболевания.

Болезни, связанные с нарушениями первичной структуры белка, полу- чили название молекулярных. К настоящему времени открыто несколько тысяч таких болезней. Все они являются наследственными заболеваниями.

Одной из молекулярных болезней является серповидноклеточная анемия, причина которой кроется в ничтожном нарушении первичной струк- туры гемоглобина. Если у здоровых людей полипептидная цепочка в молеку- ле гемоглобина, состоящая из 146 аминокислотных остатков, начинается с такой аминокислотной последовательности:

 

Вал-Гис-Лей-Тре-Про-Глу-Глу-Лиз-Сер-L,

 

то у людей с врождённой аномалией структуры гемоглобина она начинается иначе:

 

Вал-Гис-Лей-Тре-Про-Вал-Глу-Лиз-Сер-L,

 

т. е. у больных серповидноклеточной анемией в шестом положении данной полипептидной цепи гемоглобина находится валин, тогда как у здоровых людей на этом месте располагается глутаминовая кислота.

Эритроциты крови таких больных сильно отличаются по своей форме от эритроцитов здоровых людей: они имеют не дисковидную, а серповидную форму. Аномальный гемоглобин хуже транспортирует кислород, в результа- те чего больные всё время испытывают кислородное голодание и продолжи- тельность их жизни не превышает 30 лет. Это заболевание распространено в

 

некоторых районах Африки и проявляется в замедлении развития, общей слабости организма.

Таким образом, изучение гемоглобина позволило установить, что функция белка тесно связана с его первичной структурой и изменение места положения даже одной аминокислоты в полипептидной цепи может сопро- вождаться нарушением биологической функции белка.

Первичная структура белка задана генетически. Это даёт возможность организмам одного вида поддерживать постоянство набора белков. Однако у разных видов живых организмов белки, выполняющие одинаковую функ- цию, не идентичны по первичной структуре — на отдельных участках поли- пептидной цепи они могут иметь неодинаковые последовательности амино- кислот. Такие белки называют гомологичными (греч. ὅμοιος” — подоб- ный, похожий + “λογος” — слово).

Исследования конформации белковых молекул показали, что они пред- ставляют собой небольшие, очень компактные частицы. А это означает, что длинные полипептидные цепи не вытягиваются строго линейно, а каким-то образом сворачиваются в пространстве.

 

1.10.2.   Вторичная структура белка

Пространственную организацию белковых молекул изучают главным образом с помощью рентгеноструктурного анализа, который состоит в про- пускании рентгеновских лучей через кристалл исследуемого белка. Эти лучи поглощаются электронами атомов молекулы белка. В свою очередь, электро- ны равномерно испускают вторичные лучи, которые в результате интерфе- ренции (сложения) в некоторых направлениях усиливаются. За белковым кристаллом на выходе лучей помещают фотоплёнку, на которой после про- явления обнаруживается множество разных пятен, расположенных опреде- лённым образом. Эти пятна различаются степенью потемнения, определяе- мой  неодинаковой  интенсивностью  дифракции  (рассеяния)  рентгеновских

лучей в разных направлениях. Так как расположение и яркость полученных

 

пятен зависят от локализации электронов в кристалле, а электроны, как из- вестно, находятся в атомах, то анализ рентгенограммы позволяет установить пространственную атомную структуру кристалла белка.

С помощью рентгеноструктурного анализа определяют вторичную, третичную и четвертичную пространственные структуры белковых молекул.

Вторичная структура белка представляет собой сочетание упорядо- ченных и аморфных участков полипептидной цепи. Она определяется свой- ствами первичной структуры белковой молекулы, которая имеет ряд особен- ностей.

Во-первых, как установил американский биохимик Л. Полинг, изучая кристаллические структуры соединений, содержащих амидные группы, дли- на пептидной связи близка к длине двойной связи и составляет 0,1325 нм. Поэтому свободное вращение атомов углерода и азота вокруг пептидной свя- зи затруднено и повороты в полипептидной цепи могут совершаться только по связям, примыкающим к α-углеродным атомам.

Во-вторых, атомы пептидных групп и α-углеродные атомы располага- ются в полипептидной цепи приблизительно в одной плоскости. Следова- тельно, аминокислотные остатки в полипептидной цепи могут принимать лишь ограниченный набор конформаций.

Основываясь на результатах рентгенографических исследований, про- ведённых английским физиком и молекулярным биологом У. Т. Астбери в 1930-х годах, Л. Полинг и его сотрудник Р. Кори в 1951 г. установили, что для вторичной структуры белковых молекул наиболее характерны два типа упорядоченных участков: α-спираль и β-структура. Оба конформационных типа были открыты в результате изучения пространственной структуры кера- тинов: основной структурный компонент α-кератинов получил название α-спирали, а β-кератинов — β-структуры.

α-Спираль и β-структура образуются за счёт поворотов или изгибов пептидных групп вокруг α-углеродных атомов и стабилизируются за счёт об- разования водородных связей.

Водородная связь возникает в тех случаях, когда атом водорода рас- полагается между двумя электроотрицательными атомами, с одним из кото- рых он связан ковалентно. Близкое расположение второго электроотрица- тельного атома приводит к возникновению электростатического взаимодей- ствия между ним и атомом водорода, имеющим частичный положительный заряд. Водородные связи схематично изображают тремя точками · · ·.

При образовании вторичной структуры белковой молекулы водород- ные связи возникают между атомами пептидных групп. В NH-группе атом водорода, соединённый ковалентной связью с атомом азота, имеет частичный положительный заряд (δ+). В CO-группе атом кислорода, соединённый двой- ной связью с атомом углерода, имеет частичный отрицательный заряд (δ). Поэтому водородный атом в группе N–H, оказавшись напротив атома ки- слорода в группе C=O, связывается с ним водородной связью:

 

| C=O

|    δ–       δ+    | C=O L H–N

|                |

H–N

|

 

При свертывании полипептидной цепи в α-спираль водородные связи возникают между её соседними витками. При этом пептидные группы соеди- няются между собой через четыре аминокислотных остатка, так как именно эти группы располагаются на соседних витках α-спирали напротив друг дру- га, т. е. СО-группа i-го остатка аминокислоты соединяется водородной свя- зью с NН-группой (i+4)-го аминокислотного остатка, СО-группа (i+1)-го ос- татка — с NН-группой (i+5)-го и т. д.:

 

 

  • O O O             O             O             O             O

||               ||               ||               ||              ||              ||               ||

L–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–N–CH–C–L

|    |           |    |           |    |           |    |           |   |            |   |           |   |

Н Ri             Н  Ri+1          Н  Ri+2         Н Ri+3          Н Ri+4          Н Ri+5         Н Ri+6

 

α-Спираль является правозакрученной. Если смотреть на неё с торца со стороны N-конца, то закручивание полипептидной цепи происходит по часо- вой стрелке. При этом водородные связи всегда направлены параллельно во- ображаемой оси α-спирали (рис. 5):

 

Если α-спираль рассматривать в направлении от N-конца к С-концу, то все О=С-группы в ней будут направлены вперёд, Н–N-группы — назад, а бо- ковые радикалы аминокислотных остатков — наружу от её витков:

 

                                                                

  • · · H – N R8 – CH C = O · · ·

                                

R5 – CH               C = O · · · H – N C = O · · · H – N  R12 – CH

  • · · H – N R9 – CH C = O · · ·

 

R6 – CH              C = O · · · H – N C = O · · · H – N     R13 – CH

 

Установлены параметры α-спирали. Расстояние между соседними вит- ками (шаг спирали) составляет 0,544 нм, её внешний диаметр — 1,05 нм, внутренний диаметр — 1,01 нм. Один полный виток α-спирали включает в себя 3,6 аминокислотных остатка. Следовательно, полное повторение струк- туры α-спирали происходит каждые 5 витков, включающих в себя 18 амино- кислотных остатков. Этот отрезок α-спирали называется периодом идентич- ности и составляет в длину 2,7 нм.

Полипептидная цепь очень плотно упакована в виде α-спирали, и эта структура характеризуется наибольшей устойчивостью по сравнению с дру- гими спиралями (спиралями с другими параметрами), т. к. именно в α-спира- ли реализуется максимально возможное число водородных связей за счёт участия в них каждой пептидной группы полипептидной цепи. Поэтому, хотя водородная связь и слабая, однако за счёт образования большого их числа обеспечивается сохранение прочной, строго упорядоченной структуры.

Тем не менее, полипептидные цепочки сворачиваются в α-спираль не на всём своём протяжении. Процентное содержание заспирализованных уча- стков в белковой молекуле называют степенью спирализации. Белки суще- ственно различаются по степени спирализации, например: для гемоглобина она очень высокая — 75 %, для инсулина также довольно высокая — 60 %,

 

для альбумина куриного яйца значительно ниже — 45 %, а для химотрипси- ногена (неактивного предшественника фермента пищеварения) крайне низ- кая — всего 11 %. Степень спирализации полипептидной цепи определяется её аминокислотной последовательностью.

Различия в степени спирализации белков связаны с рядом факторов, мешающих регулярному образованию водородных связей между пептидны- ми группами. К нарушению спирализации приводит, в частности, образова- ние остатками цистеина дисульфидных связей, соединяющих различные уча- стки полипептидной цепи. Несколько стоящих подряд аминокислотных ос- татков с одноимённо заряженными радикалами вследствие их сильного вза- имного отталкивания также не могут участвовать в образовании α-спирали. Кроме того, остаток иминокислоты пролина не имеет Н–N-группы, необхо- димой для образования структурообразующей водородной связи в α-спирали, и, к тому же, вокруг его α-углеродного атома невозможно вращение соседних атомов. Поэтому в полипептидной цепи в области, близкой к остатку проли- на, образуется изгиб:

 

H             O

|               ||

N             C

N       C          CH          ···

|         ||            |

O = C       O           Ri+2 CH – Ri

H – N

M

 

Ряд протеиногенных аминокислот обладают радикалами довольно больших размеров. Близкое соседство в полипептидной цепи аминокислот- ных остатков с такими радикалами затрудняет им участие в образовании α-спирали. Остатки этих аминокислот активно участвуют в формировании не спиральной, а зигзагообразной структуры, в которой отдельные вытянутые

 

участки полипептидной цепи уложены параллельно друг другу. Такой тип регулярного участка полипептидной цепи получил название β-структуры.

При этом остов полипептидной цепи в β-структуре не лежит в одной плоскости, а за счёт изгибов при α-углеродных атомах образует складки. Та- ким образом, в отличие от α-спирали, имеющей стержневую форму, β-струк- тура имеет форму складчатого листа. Поэтому её также называют структу- рой складчатого слоя.

β-Структура стабилизируется водородными связями, возникающими между пептидными группами, расположенными на соседних отрезках поли- пептидной цепи. Эти отрезки могут быть направлены либо в одну сторону — тогда образуется параллельная β-структура (рис.6, А), либо в противополож- ные — в этом случае возникает антипараллельная β-структура (рис. 6, Б).

Пептидные группы в β-структуре располагаются в плоскостях складок, а боковые радикалы остатков аминокислот направлены перпендикулярно плоскости складчатого слоя и располагаются над или под ней. Расстояние между соседними тяжами полипептидной цепи в структуре складчатого слоя составляет 0,272 нм, что соответствует длине водородной связи между груп- пами С=О и N–H. Сами водородные связи располагаются перпендикулярно направлению структуры складчатого слоя.

Содержание β-структуры в различных белках колеблется в широких пределах. Так, в эластазе (ферменте пищеварения) оно составляет 52 %, ин- сулине — 24 %, лизоциме (фермент, разрушающий клеточные оболочки бак- терий, т. е. обладающий антибактериальным действием; он содержится в местах соприкосновения животного организма с окружающей средой: слюне, слизистой оболочке желудка, слёзной жидкости, слизи носоглотки и т. п.) — 16 %, а в миоглобине — равно нулю.

 

Некоторые участки полипептидных цепочек не имеют какой-либо упо- рядоченной структуры и представляют собой беспорядочные клубки, со- стоящие  из   «случайных»  поворотов  и   изгибов.  Такие   участки называют

аморфными  (греч.  “ά  ορφος”  — бесформенный).  Однако  в каждом белке

аморфные участки имеют свою фиксированную конформацию. При этом в отличие от относительно жёстких участков — α-спирали и β-структуры — аморфные клубки могут сравнительно легко изменять свою конформацию.

Белки различаются не только по содержанию разных элементов вто- ричной структуры, но и по сочетанию α-спиралей и складчатых слоёв в од- ной молекуле. Наиболее типичными являются следующие сочетания: две ан- типараллельно расположенные α-спирали (αα-структура); два антипарал- лельно идущих тяжа β-структуры (ββ-структура); α-спираль, окружённая двумя тяжами β-структуры (βαβ-структура).

В зависимости от присутствия в полипептидной цепи тех или иных элементов вторичной структуры и их сочетаний белки разделяют на несколь- ко типов. Существуют α-спиральные белки, вторичная структура которых построена главным образом из α-спиралей. Типичным представителем бел- ков этого типа является гемоглобин. Белки, вторичная структура которых об- разована в основном складчатыми слоями, составляют группу β-белков. К белкам данного типа принадлежат иммуноглобулины, фиброин шёлка, фер- мент пепсин и др. У многих белков вторичная структура представляет собой чередование α-спиралей и тяжей β-структуры. Это α/β-белки. Такой про- странственной структурой обладает, например, фермент триозофосфатизоме- раза. Существуют также (α + β)-белки. Их вторичная структура образована путём группировки α-спиралей и тяжей β-структуры, в результате чего одна часть молекулы таких белков состоит из α-спиралей, а другая — из складча- тых слоёв. К белкам такого типа относится, например, лизоцим куриного яй- ца.

 

Широко встречаются и такие белки, у которых упорядоченные участки присутствуют в незначительном количестве, а большая часть полипептидной цепочки имеет аморфную структуру.

Объединение элементов вторичной структуры представляет собой но- вый уровень организации полипептидной цепи, который получил название надвторичной структуры.

Полипептидные цепочки со сформированной вторичной и надвторич- ной структурами определённым образом располагаются в пространстве, соз- давая ещё один уровень организации белковой молекулы — третичную структуру.

 

1.10.3.   Третичная структура белка

Третичная структура белка образуется в результате специфической укладки упорядоченных и аморфных участков полипептидной цепи в неко- тором объёме пространства. Она поддерживается за счёт сильных и слабых взаимодействий, возникающих между боковыми радикалами остатков ами- нокислот, и обуславливает форму белковой молекулы. К сильным взаимо- действиям относится дисульфидная связь, а к слабым — водородная и ион- ная связи, а также гидрофобные взаимодействия.

Дисульфидная связь образуется при взаимодействии двух близко рас- положенных друг к другу радикалов остатков цистеина, содержащих свобод- ные сульфгидрильные группы (SH-группы):

L–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–L

|                    |                     |

Ri                             CH2                           Ri+2

|

S

|

S

|

Rj+2                          CH2                        Rj

|                    |                     |

L–CO–CH–NH–CO–CH–NH–CO–CH–NH–L

 

При формировании третичной структуры белка дисульфидные мостики соединяют между собой отдельные участки внутри одной полипептидной цепи.

 

H2N

 

 

COOH

 

Водородная связь может возникать между боковыми радикалами ос- татков аминокислот, содержащих ОН-группы, например, между двумя остат- ками серина:

 

L–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–L

|                     |                     |

Ri                             CH2                          Ri+2

| О–Н

 

О–Н

|

Rj+2                          CH2                        Rj

|                     |                    |

L–CO–CH–NH–CO–CH–NH–CO–CH–NH–L

Кроме радикалов остатков серина, водородные связи таким же образом могут образовывать радикалы остатков треонина и тирозина.

Помимо этого в формировании третичной структуры белковой молеку- лы могут принимать участие водородные связи, возникающие между боко- выми радикалами остатков, например, тирозина и аспарагиновой кислоты, глутамина и серина, лизина и аспарагина, а также множество других:

 

  • ··–NH–CH–CO–··· ···–NH–CH–CO–··· ···–NH–CH–CO–···

|                                  |                               |

СН2                            CH2                         CH2

|                               |

CH2                       (CH2)3

|                               |

С=О                   H–N+–H

|                              |

О–Н                            N–Н                       Н

|

О                            Н                            О

||                                                             ||

C–О                       О–Н                       С–NН2

|                               |                              |

CH2                         CH2                         CH2

|                               |                              |

  • ··–CO–CH–NH–··· ···–CO–CH–NH–··· ···–CO–CH–NH–···

 

Ионные, или солевые, связи образуются под воздействием электро- статических сил, которые возникают при сближении разноимённо заряжен- ных химических групп: отрицательно заряженных радикалов остатков кис- лых аминокислот — аспарагиновой или глутаминовой — с положительно за- ряженными радикалами остатков основных аминокислот — лизина, аргинина или гистидина. Так, например, образуется ионная связь между радикалами остатков аспарагиновой кислоты и лизина:

 

L–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–L

|                     |                     |

Ri                              CH2                         Ri+2

| С=О

|  О–

 

+NH3

|

Rj+2                       (CH2)4                     Rj

|                    |                     |

L–CO–CH–NH–CO–CH–NH–CO–CH–NH–L

 

К основным группам в белке также относится α-аминогруппа N-конце- вой аминокислоты, а к кислотным группам — α-карбоксильная группа C-концевой аминокислоты. Они также могут принимать участие в образова- нии ионных связей в белковой молекуле.

Гидрофобные взаимодействия возникают в водной среде вследствие притяжения друг к другу неполярных радикалов остатков аминокислот, ко- торые стремятся избежать соприкосновения с водой, подобно тому, как это имеет место у липидов. В образовании этих слабых нековалентных взаимо- действий особенно активно принимают участие боковые радикалы остатков аланина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и метионина, напри- мер:

 

M                         L–NH–CH–CO–L                            M

|                                       |                                             |

CO                                  CH3       CH3                          NH

|                          CH3                               CH2               | CH–CH2–CH                        Н3С       СН3                    CH–CH

|                          CH3                                CH3              | NH                                               CH                                 CO

|                                               |                                      |

M                                 L–CO–CH–NH–L                     M

Вода является обязательным компонентом любой живой клетки и со- ставляет в среднем 70 % массы живых организмов. Таким образом, это самое распространённое вещество в живой природе. Все метаболические процессы протекают в водной среде.

Значение воды как биологического растворителя обусловлено её рез- кими отличиями по физическим свойствам от всех других жидкостей. Эти отличия определяются строением молекул воды и характером межмолеку- лярных связей.

Молекула воды имеет симметричное угловое строение, при этом на од- ной стороне молекулы располагается атом кислорода, несущий частичный отрицательный заряд, а на противоположной — атомы водорода, несущие

 

частичные положительные заряды. Таким образом, в целом электроней- тральная молекула воды представляет собой диполь (греч. “δί” — два + “πόλος” — полюс).

Полярные молекулы воды взаимодействуют между собой с образова- нием водородных связей. Максимально одна молекула воды может прини- мать участие в образовании четырёх водородных связей с соседними молеку- лами воды:

 

Н            Н

О

M

Н

| O

N M     H

H    H       O         H

O             |            O

|             O            |

H                    H    H

 

Именно такая структура характерна для кристаллов льда. В жидкой во- де в нормальных условиях одна её молекула образует водородные связи в среднем с 3,4 других молекул воды. Однако, в отличие ото льда, в жидкой воде эти связи короткоживущие: они быстро рвутся и образуются вновь. Следствием этого является неоднородность структуры воды. В ней сосуще- ствуют наряду со свободными молекулами воды довольно долгоживущие льдоподобные кластеры (англ. “cluster” — скопление), имеющие форму по- лых многогранников и различающиеся размерами и сложностью строения.

При попадании гидрофобных частиц, не способных образовывать во- дородные связи, в воду её молекулы «раздвигаются» и переориентируются таким образом, чтобы образовать максимально возможное число водородных связей между собой. В результате возрастает структурированность воды, и при этом часть гидрофобных частиц оказывается включённой внутрь полос-

 

тей льдоподобных кластеров. Всё это препятствует растворению гидрофоб- ных частиц в водной среде и вызывает их вытеснение и отслаивание от воды. При растворении в воде белка отслаивания гидрофобных радикалов аминокислотных остатков происходить не может, так как они входят в состав полипептидной цепи. Поэтому, чтобы избежать контакта с водным окруже- нием, неполярные радикалы остатков аминокислот стремятся собраться вме- сте внутри белковой молекулы, в результате чего белок сворачивается в ком- пактное тело — глобулу (лат. “globulus” — шарик), внутри которой образу-

ется сухое гидрофобное ядро.

При сворачивании длинных полипептидных цепей, молекулярная масса которых превышает 14000 Да, могут формироваться два или более независи- мых гидрофобных ядер. Так в белковой глобуле возникают структурно обо- собленные части, получившие название доменов (фр. “domaine” — область). Отдельные домены связаны между собой гибкими частями полипептидной цепи.

На поверхности глобулы располагаются гидрофильные радикалы ами- нокислотных остатков (серина, треонина, тирозина, аспарагина, глутамина, кислых и основных аминокислот), которые взаимодействуют с молекулами воды, устанавливая с ними многочисленные водородные связи. Здесь же мо- гут находиться и до половины имеющихся в полипептидной цепочке гидро- фобных радикалов, которые удерживаются на поверхности глобулы, будучи заключёнными в полостях льдоподобных кластеров.

Таким образом, белковая глобула окружена гидратной оболочкой, так называемой «водяной шубой», наличие которой обуславливает раствори- мость белков. При этом степень их растворимости определяется соотноше- нием гидрофильных и гидрофобных групп в полипептидной цепи, а также их расположением в белковой глобуле. Чем больше гидрофильных и меньше гидрофобных групп располагается на поверхности белковой глобулы, тем выше растворимость белка.

 

Гидрофильные свойства радикалов одних аминокислотных остатков и гидрофобные взаимодействия других оказывают решающее влияние на фор- мирование пространственной структуры белковой молекулы. Помимо этого распределение заряженных остатков аминокислот в полипептидной цепи также сильно влияет на пространственную конформацию белковой молеку- лы, так как близко расположенные одноимённые заряды, как известно, от- талкиваются, а разноимённые — притягиваются. Силы, принимающие уча- стие в стабилизации третичной структуры белков.

COOH

дисульфидная

связь                               S            вал      лей             гидрофобные

|                                           взаимодействия

S            фен      мет

|

|                    |

C=O              O

|                    |                            водородная

ионная                      O                 H                           связь между

связь                                               M                            R-группами

+NH3              O–H

 

H2N

 

Благодаря множеству межрадикальных взаимодействий, отдельные участки белковой молекулы оказываются пространственно сближенными и зафиксированными относительно друг друга. В ходе образования третичной структуры белка формируется его активный центр. В результате белок при- обретает способность выполнять свою биологическую функцию. Следова- тельно, функция белка будет проявляться после формирования его третичной структуры.

Таким образом, функции белковых молекул проявляются в результате формирования их объёмных трехмерных структур. Поэтому функции белков невозможно вывести и понять, изучая двумерные структурные формулы, на

 

основе которых строится изучение соединений в классическом курсе органи- ческой химии. Поэтому рассмотрению структурной организации белковой молекулы и взаимосвязи между структурой и функцией белков уделяется в биохимии большое внимание.

Процесс формирования пространственной структуры белка называют фолдингом (англ. “folding” — сворачивание) белка. Раньше считали, что пространственная упаковка возникает в белке самопроизвольно, без участия каких-либо других молекул. Но в последнее время было обнаружено, что важную роль в фолдинге белков играют специфические белки, названные шаперонами и шаперонинами (англ. “chaperon” — так в Англии называли пожилую даму, удерживающую от непродуманных контактов молодую де- вушку, впервые выходящую в свет под её руководством).

Шапероны построены достаточно просто: они состоят из одной или двух полипептидных цепей. За счёт гидрофобных взаимодействий эти белки фиксируют сходящую с рибосомы полипептидную цепь, в результате чего она теряет необходимую для сворачивания подвижность и удерживается в развёрнутом состоянии. От шаперонов полипептидная цепь поступает к ша- перонину — другому белку, обеспечивающему оптимальные условия для её сворачивания. Структура шаперонина сложная: она напоминает бочонок, об- разованный двумя семичленными кольцами, расположенными одно под дру- гим. Пока ещё неорганизованная полипептидная цепь вовлекается внутрь этого бочонка, после чего вход в него прикрывается семичленным белковым кольцом другого шаперонина. В результате полипептидная цепь оказывается в полной изоляции от внешней среды и под контролем шаперонинов может без помех образовывать вторичную, надвторичную, доменную структуры и укладываться в глобулу. По завершении сворачивания белковая глобула вы- ходит из шаперонина во внешнюю среду.

Первым белком, третичная структура которого была установлена, явля- ется миоглобин, выделенный из скелетных мышц кашалота. Сведения о про- странственной структуре этого белка впервые были получены английским.

 

Миоглобин представляет собой полипептидную цепочку, состоящую из 153 аминокислотных остатков. Дж. К. Кендрью было выяснено, что молекула этого белка на уровне третичной структуры компактна, а полипептидная цепь образует восемь спирализованных участков (рис. 10); при этом, почти все по- лярные группы располагаются на её поверхности, а неполярные группы об-

 

ращены внутрь молекулы и образуют там гидрофобное ядро. В результате специфической укладки полипептидной цепочки миоглобина в глобулу в ней образуется полость, внутри которой помещается гем — небелковый компо- нент, представляющий собой большую плоскую органическую молекулу, имеющую циклическое строение и содержащую железо.

В настоящее время уже установлена третичная структура нескольких сотен белков. Строение, подобное структуре миоглобина, имеют глобулы многих белков.

 

1.10.4.   Четвертичная структура белка

Многие белковые глобулы взаимодействуют между собой с образова- нием единой молекулы. Пространственная организация возникающих ан- самблей глобул определяет четвертичную структуру белковой молекулы. Таким образом, белки, обладающие четвертичной структурой, состоят из не- скольких полипептидных цепей, сформировавших вторичную и третичную структуры. Четвертичная структура присуща примерно половине всех из- вестных белков. Эти белки обладают молекулярной массой, как правило пре- вышающей 50000 Да.

Глобулы, составляющие белковую молекулу, обладающую четвертич- ной структурой, называют субъединицами. На каждой субъединице распо- лагается свой активный центр. Определённым образом располагаясь в про- странстве относительно друг друга, субъединицы образуют ансамбли, назы- ваемые олигомерными (или мультимерными) комплексами. Способность белков к образованию таких структур позволяет объединять в единое целое несколько активных центров и взаимосвязанных функций, что очень важно для обеспечения протекания в клетке сложных обменных процессов. Актив- ный центр олигомерного комплекса может образовываться также остатками аминокислот, распложенных на разных субъединицах.

Таким образом, четвертичная структура представляет собой способ со- вместной укладки и упаковки субъединиц, вследствие чего образуются

 

функционально активные центры белка, обуславливающие его биологиче- скую активность. Каждая субъединица в отдельности биологической актив- ностью не обладает.

Субъединицы удерживаются вместе главным образом за счёт слабых взаимодействий. Бóльшую роль в становлении четвертичной структуры бел- ков играют гидрофобные взаимодействия и меньшую — водородные связи. Ионные связи тоже участвуют в образовании четвертичной структуры, но формироваться они могут не только между противоположно заряженными функциональными группами субъединиц, но и при взаимодействии ионов металлов с радикалами остатков кислых аминокислот. Иногда в стабилиза- ции четвертичной структуры белка принимают участие дисульфидные связи.

 

H2N                           COOH

 

S           S

|            |

S          S

 

H2N                           COOH

 

Однако встречаются белки, которые состоят из двух или более поли- пептидных цепей, но при этом не обладают четвертичной структурой. При- мером такого белка может служить бычий инсулин. Две его полипептидные цепочки составляют единую глобулу. Это объясняется тем, что он образуется из проинсулина — полипептида, состоящего из 81 аминокислотного остатка и уже имеющего сформированную третичную структуру — путём «выреза- ния» из него пептида С, соединяющего цепи А и В (см. рис. 4).

Соединение субъединиц друг с другом с образованием олигомерного комплекса происходит при взаимодействии строго определённых участков их поверхностей, называемых контактными. Контактирующие участки субъеди- ниц комплементарны (лат. “complementum” — дополнение) друг другу: они

 

характеризуются пространственным и химическим соответствием располо- женных на них химических групп. При взаимном контакте таких участков соответствующие химические группы пространственно совпадают и между субъединицами возникают водородные и ионные связи, устанавливаются гидрофобные контакты.

Четвертичные структуры белков могут строиться из различного числа субъединиц — из 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 или более и редко — из нечётного их числа. Чаще всего встречаются олигомерные белки, построенные из двух и из четырёх субъединиц. Субъединицы в олигомерах могут быть либо одинако- выми, либо разными. Например, четвертичную структуру гемоглобина обра- зуют четыре попарно одинаковые субъединицы.

 

Пространственную структуру гемоглобина, который был выделен из крови лошади, установил с помощью рентгеноструктурного анализа англий- ский биохимик М. Ф. Перутц в 1959 г. Этот белок состоит из 574 аминокис- лотных остатков: каждую α-субъединицу образует 141 аминокислотный ос- таток, а каждую β-субъединицу — 146. Отдельная субъединица гемоглобина напоминает своим строением структуру миоглобина. Молекула гемоглобина содержит четыре гема: по одному в каждой субъединице.

Четвертичную структуру белков можно непосредственно наблюдать методом электронной микроскопии.

 

Под влиянием различных агентов можно осуществить диссоциацию олигомерного белка на субъединицы; при этом будет утрачена его биологи- ческая активность. Диссоциация белков часто бывает обратимой. После уда- ления соответствующего агента четвертичная структура белковой молекулы самопроизвольно восстанавливается; при этом восстанавливается и утрачен- ная функция белка. Таким образом, олигомерные белки проявляют свою биологическую функцию лишь на уровне четвертичной структуры.

От олигомерных белков следует отличать белки, находящиеся в агре- гированном состоянии. При агрегации глобул одного и того же белка нико- гда не возникает какой-либо новой биологической активности по сравнению с той, которой обладает белковая молекула на уровне третичной структуры. При диссоциации белкового агрегата специфическая биологическая актив- ность составлявших его молекул сохраняется.

Четвертичная структура белковой молекулы является такой же уни- кальной, как и другие её структуры. При этом вся трёхмерная упаковка по- липептидной цепи в пространстве (вторичная, третичная и, если имеется, четвертичная структуры) определяется её первичной структурой. Это означа- ет, что в самой последовательности аминокислот запрограммирована трёх- мерная пространственная структура белковой молекулы.

Специфическая пространственная структура (конформация), в кото- рой белковые молекулы, находящиеся в природных физиологических усло- виях, обладают биологической активностью, называется нативной (лат. “na- tivus” — врождённый).

 

1.11.   Физико-химические свойства белков

Форма белковой молекулы. Исследования нативной конформации белковых молекул показали, что эти частицы в большинстве случаев имеют более или менее асимметричную форму. В зависимости от степени асиммет- рии, т. е. соотношения между длинной (b) и короткой (a) осями белковой мо- лекулы, различают, согласно предложению У. Т. Астбери (1935 г.), глобу-

 

лярные (шаровидные) и фибриллярные (нитевидные, от лат. “fibra” — во- локно) белки.

Глобулярными являются белковые молекулы, у которых свёртывание полипептидных цепочек привело к образованию сферической структуры. Среди них встречаются строго шаровидные, эллипсовидные и палочкообраз- ные молекулы. Они различаются по степени асимметрии. Например, яичный альбумин имеет b/a = 3, глиадин пшеницы — 11, а зеин кукурузы — 20. Мно- гие белки в живой природе являются глобулярными: к ним относятся почти все ферменты, транспортные белки крови, пищевые белки и др.

Фибриллярные белки представляют собой длинные высокоасиммет- ричные нитевидные молекулы, полипептидные цепи которых вытянуты вдоль одной оси. Большинство из них выполняет структурную, механиче- скую или защитную функцию. Типичными фибриллярными белками являют- ся кератины, коллаген (b/a = 200), фиброин.

Белкам каждой из групп присущи свои характерные свойства. Глобу- лярные белки, как правило, хорошо растворимы в воде и разбавленных соле- вых растворах, а фибриллярные — не растворимы. Растворимым фибрилляр- ным белкам свойственны очень вязкие растворы. Глобулярные белки, как правило, обладают хорошей биологической ценностью — усваиваются в процессе пищеварения, в то время как многие фибриллярные белки — нет.

Между глобулярными и фибриллярными белками отсутствует чёткая граница. Ряд белков занимает промежуточное положение и сочетает в себе признаки как глобулярных, так и фибриллярных. К таким белкам относятся, например, миозин мышц (b/a = 75) и фибриноген крови (b/a = 18). Миозин имеет палочковидную форму, сходную с формой фибриллярных белков, од- нако, подобно глобулярным белкам, он растворим в солевых растворах. Рас- творы миозина и фибриногена вязкие. Эти белки усваиваются в процессе пищеварения. В то же время актин — глобулярный белок мышц — не усваи- вается.

 

Денатурация белка. Нативная конформация белковых молекул не яв- ляется жёсткой, она довольно лабильна (лат. “labilis” — скользящий) и при ряде воздействий может серьёзно нарушаться. Денатурацией (лат. “dena- turare” — лишать природных свойств) белка называется такое нарушение его нативной конформации, которое сопровождается изменением его нативных свойств, но не сопровождается разрывом пептидных связей.

Таким образом, денатурация белка может быть вызвана различными относительно мягкими воздействиями, приводящими к нарушению в его мо- лекулах слабых взаимодействий — водородных, ионных связей и гидрофоб- ных контактов, а также к разрыву дисульфидных связей, стабилизирующих нативную структуру белка. При этом нарушаются вторичная, третичная и четвертичная структуры белковых молекул, но не нарушаются ковалентные связи в полипептидной цепи, следовательно, не нарушается и первичная структура белка.

К нарушению различных связей в большинстве белков приводит, пре- жде всего, их нагревание до температуры выше 50 °С, а также ультрафиоле- товое и другие виды высокоэнергетического облучения, что обусловлено усилением колебаний атомов полипептидной цепи. Денатурацию белка спо- собны вызвать даже механические воздействия, например сильное взбалты- вание раствора белка.

Скорость и степень денатурации белков при нагревании зависят от температуры нагревания и его продолжительности. Денатурация тем глубже, чем выше температура и чем продолжительнее нагревание. Кроме того, сте- пень и скорость денатурации белка зависят также от его влажности: в водном растворе белки денатурируют гораздо быстрее, чем в высушенном состоя- нии.

Денатурация белков также может происходить вследствие какого-либо химического воздействия, например в присутствии некоторых органических растворителей (спирта, ацетона и др.), мочевины, ионов тяжёлых металлов и др., а также в условиях экстремальных значений pH среды.

 

Сильные кислоты или щёлочи влияют на ионизацию кислотных и ос- новных групп, вызывая нарушение ионных и некоторых водородных связей в молекулах белков. Молекула мочевины (H2N–CO–NH2), своей структурой напоминающая пептидные группы, конкурирует с этими и другими группами в белках за образование водородных связей, нарушая их систему. Органиче- ские растворители — спирты, фенолы и др. также нарушают в белках систе- му водородных связей в результате конкуренции с функциональными груп- пами белков за их образование. Кроме этого органические растворители вследствие установления контактов с неполярными радикалами остатков аминокислот нарушают в белках гидрофобные взаимодействия. Высокие концентрации мочевины или органических растворителей вызывают нару- шение структуры воды, что также приводит к ослаблению в белковых моле- кулах гидрофобных взаимодействий. Слабые взаимодействия нарушают и ионы тяжёлых металлов.

Дисульфидные связи в белках разрушает 2-меркаптоэтанол:

 

L–NH–CH–CO–L                               L–NH–CH–CO–L

|

CH2

 

|

CH2

 

|

 

|

S

|

2HS–CH2–CH2–OH

 

+

S–CH2–CH2–OH

|

S

|

2-Меркаптоэтанол

|

 

S–CH2–CH2–OH

2,2′-Дигидрокси-

CH2

|

 

CH2

|

 

диэтилдисульфид

L–OC–CH–HN–L                               L–OC–CH–HN–L

Остаток цистина                                 Два остатка цистеина

 

При денатурации происходит изменение свойств белка и, в первую очередь, уменьшение его растворимости. Так, при кипячении белки коагули- руют и выпадают из растворов в осадок в виде сгустков. Это происходит, на- пример, при варке куриного яйца: если медленно нагревать яичный альбумин (белок яйца), он постепенно мутнеет и, наконец, превращается в вязкий сгу-

 

сток (коагулирует). После охлаждения этот белок оказывается нераствори- мым. Это изменение растворимости белка является необратимым.

Осаждение белков из растворов происходит также под воздействием белковых осадителей, в качестве которых применяют реактив Барнштейна (смесь гидроксида натрия с сульфатом меди), раствор трихлоруксусной ки- слоты, уксуснокислого свинца, гидроксида меди, таннина или др.

В процессе денатурации трёхмерная структура белковой молекулы на- рушается, полипептидная цепь полностью или частично развёртывается, мо- лекула приобретает гораздо более рыхлую структуру. Вследствие этого по- вышается вязкость данного белка в растворе. Кроме того, при денатурации уменьшается водопоглотительная способность белка, т. е. его способность к набуханию; могут появляться новые химические группы, например: при воз- действии 2-меркаптоэтанола — SH-группы.

Так как специфические биологические функции белка возникают на уровне его третичной или четвертичной структуры, то денатурация, сопро- вождающаяся нарушением этих уровней структурной организации белка, приводит к частичной или полной потере белком его биологической активно- сти. Например, если воздействовать на находящийся в растворе фермент трипсин возрастающими концентрациями мочевины (типичного денатури- рующего агента), то по мере нарушения его вторичной и третичной структур, которое сопровождается возрастанием характеристической вязкости раство- ра, происходит одновременное ослабление его каталитической функции; в конце концов фермент свою функцию полностью утрачивает. Если же моче- вину постепенно удалить из раствора, например, методом диализа, то проис- ходит ренатурация денатурированного белка: нативная структура, а вместе с ней и каталитическая функция трипсина полностью восстанавливаются.

Этот опыт является примером обратимой денатурации белков, при ко- торой их нативная конформация и нативные свойства могут быть, в той или иной степени, восстановлены, если убрать из среды денатурирующий агент.

 

Однако хотя первичная структура белка при денатурации не нарушает- ся, денатурационные изменения в белках в большинстве случаев являются необратимыми. Примером необратимой денатурации могут служить изме- нения, происходящие с белком куриного яйца при его варке.

Денатурация белков имеет большое значение в явлениях живого мира. Так, по мере старения организмов происходит постепенная, хотя и очень медленная, денатурация белков, сопровождающаяся снижением их гидро- фильности. Примером подобной необратимой денатурации является старение семян, которые, даже при наиболее благоприятных условиях хранения, в конце концов, теряют способность к прорастанию.

Денатурация белков имеет место и очень важна в целом ряде процессов пищевой промышленности: при выпечке хлеба и кондитерских изделий, при сушке макарон, при изготовлении консервов и т. д. Денатурированные (час- тично разрушенные) белки, как правило, значительно легче усваиваются ор- ганизмом, т. к. в процессе пищеварения они легче гидролизуются под воз- действием специфических катализаторов — ферментов. Следовательно, де- натурация белков, происходящая в ходе производства пищевых продуктов, а также приготовления пищи, имеет положительное значение, так как в резуль- тате неё повышается степень усвоения белков.

Изоэлектрическая точка белка. В белках содержатся различные ос- новные и кислотные группы, которые обладают способностью к ионизации. Поэтому почти при всех условиях белки являются полиэлектролитами.

В сильнокислой среде белок ионизируется по типу оснований: в нём активно протонируются основные группировки (аминогруппы и др.) и моле- кулы белка приобретают суммарный положительный заряд. В сильнощелоч- ной среде белок ионизируется по типу кислот: в нём легко диссоциируют карбоксильные группы и молекулы белка приобретают суммарный отрица- тельный заряд.

Источниками положительного заряда в белках выступают боковые ра- дикалы остатков лизина, аргинина и гистидина, α-аминогруппа остатка N-

 

концевой аминокислоты. Источниками отрицательного заряда — боковые радикалы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, α-карбоксильная группа остатка С-концевой аминокислоты. Именно эти аминокислоты, входя в состав белка, определяют его кислотно-основные свойства.

Что же касается α-аминных и α-карбоксильных групп остальных ами- нокислот, входящих в состав белка, то они в его кислотно-основные свойства не вносят никакого вклада, поскольку эти группы вовлечены в образование ковалентных пептидных связей и уже не способны к ионизации.

По мере понижения кислотности среды протонирование основных групп в белковых молекулах уменьшается, а диссоциация карбоксильных групп — усиливается. При понижении щёлочности белкового раствора, на- против, уменьшается диссоциация карбоксильных групп и усиливается про- тонирование основных. При каком-то определённом значении pH среды в белке возникает равное количество положительных и отрицательных заря- дов, т. е. его суммарный электрический заряд оказывается равным нулю. Та- кое значение рН раствора, при котором молекула белка электронейтральна, называют изоэлектрической точкой белка (рI). В изоэлектрической точке белок теряет способность передвигаться в электрическом поле.

Значение изоэлектрической точки является характерной константой белка. Она определяется его аминокислотным составом и структурой: коли- чеством и расположением остатков кислых и основных аминокислот в поли- пептидной цепи. Изоэлектрические точки белков, в которых преобладают ос- татки кислых аминокислот, располагаются в области рН<7, а белков, в кото- рых преобладают остатки основных аминокислот, — в области рН>7. Изо- электрические точки большинства белков находятся в слабокислой среде и близки к 7, что обусловлено приблизительно одинаковым содержанием в мо- лекулах белков кислых и основных аминокислотных остатков.

В изоэлектрическом состоянии растворы белков обладают минималь- ной вязкостью. Это связано с изменением формы белковой молекулы. В изо- электрической точке разноимённо заряженные группы притягиваются друг к

 

другу, и белки закручиваются в клубки. При смещении рН от изоэлектриче- ской точки одноимённо заряженные группы отталкиваются, и молекулы бел- ка развёртываются. В развёрнутом состоянии белковые молекулы придают растворам более высокую вязкость, чем свёрнутые в клубки.

В изоэлектрической точке белки обладают минимальной растворимо- стью, и в таком состоянии их легче всего осадить. Графически зависимость растворимости белка от рН сред.

Раствори-  100 мость, %

 

0            pI  7             рН

 

Однако если просто довести рН раствора белка до изоэлектрической точки, белок сам по себе в осадок не выпадет. Этому препятствуют как раз- личные гидрофильные группировки, находящиеся на поверхности белковых глобул и обладающие способностью связывать молекулы воды, так и струк- турированные молекулы воды, удерживающие на поверхности белковых глобул значительную часть гидрофобных аминокислотных радикалов. Таким образом, располагающаяся вокруг глобулы водная оболочка препятствует аг- регации молекул белка и их выпадению в осадок.

Чтобы осадить белок, надо к его раствору добавить какое-либо вещест- во, обладающее сильной водоотнимающей способностью. Например, белки можно осадить с помощью органических растворителей (спирта, ацетона), нарушающих систему гидрофобных контактов в молекулах белка, а также высоких концентраций солей (методом высаливания), уменьшающих гидра- тацию белковых глобул. В последнем случае часть воды идёт на растворение соли и перестаёт участвовать в растворении белка. Такой раствор за недос-

 

татком растворителя становится пересыщенным, что влечёт за собой выпаде- ние части его в осадок. Белковые молекулы начинают слипаться и, образуя всё более крупные частицы, постепенно осаждаются из раствора.

Ультрафиолетовый спектр белка. Растворы белков имеют характер- ный спектр поглощения электромагнитного излучения в ультрафиолетовой области (рис. 14).

 

D, оптическая плотность

0      190         280         λ, нм

 

Получаемые УФ-спектры белковых растворов имеют максимумы по- глощения при длине волны 190 нм и 280 нм. Поглощение при 190 нм обу- словлено пептидными группами белка, а поглощение при 280 нм — его аро- матическими группами.

По оптической плотности, измеренной при определённой длине волны, можно установить количество белка в растворе. Чем она выше, тем выше концентрация белка. Однако этот метод имеет ограничения: во-первых, не- обходим раствор белка и, во-вторых, этот раствор должен быть не опалесци- рующим, т. е. абсолютно прозрачным.

Оптические свойства белка. Растворы белков обладают оптической активностью, т. е. способностью вращать плоскость поляризации света. Это свойство белков обусловлено наличием в их молекулах элементов асиммет- рии — асимметрических атомов углерода и правозакрученной α-спирали.

При денатурации белка происходит изменение его оптических свойств, что связано с разрушением α-спирали. Оптические свойства полностью дена-

 

турированных белков зависят только от наличия в них асимметрических ато- мов углерода.

По разнице в проявлении белком оптических свойств до и после дена- турации можно определить степень его спирализации.

Качественные реакции на белки. Для белков характерны цветные ре- акции, обусловленные наличием в них тех или иных химических группиро- вок. Эти реакции часто используют для обнаружения белков.

При добавлении к белковому раствору сульфата меди и щёлочи появ- ляется сиреневое окрашивание, связанное с образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка. Поскольку эту реакцию даёт биурет (H2N–CO–NH–CO–NH2), она получила название биуретовой:

 

 

O

O

O

O

О

||

||

||

||

||

L-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-L + 4NaOH + CuSO4

|    |            |    |            |    |            |    |            |    |

H Rx           Н Rx+1     Н Rx+2     Н Rx+3      Н Rx+4

Фрагмент полипептидной цепи

 

 

Rx

ONa

Rx+1

|

|

|

L= N – CH – C = N – CH – C = N

O          |

|          CH – Rx+2

Cu – O  |               + Na2SO4 + 4H2O

OH                               C

|                                    ||

L– C – CH – N = C – CH – N

|               |      |

Rx+4        NaO    Rx+3

Биуретовый комплекс

 

Биуретовую реакцию используют для количественного определения белка, наряду с методом И. Кьельдаля, т. к. интенсивность возникающей ок- раски прямо пропорциональна концентрации белка в растворе.

 

При нагревании растворов белков с концентрированной азотной кисло- той может появляться жёлтое окрашивание, обусловленное образованием нитропроизводных ароматических аминокислот. Эту реакцию называют ксантопротеиновой (греч. “ξάνθος” — жёлтый):

 

L–НN–СН–СО–L                                  L–НN–СН–СО–L

|                                                                  |

СН2                                                            СН2

 

+ 2HNO3                                                   + 2H2O

 

O = N                 N = O

||                   ||

ОН                                                  O        ОН    O

Остаток тирозина                             Остаток динитротирозина

 

При добавлении щёлочи нитропроизводные ароматических аминокис- лот образуют соли, вследствие чего жёлтая окраска переходит в оранжевую:

 

L–НN–СН–СО–L                                   L–НN–СН–СО–L

|                                                                   |

СН2                                                             СН2

 

+  NaOH                                                   + H2O

 

O = N                N = O                               O = N                 N = O

||                  ||                                             |         ||         ||

О        ОН    О                                            ONa   О        O

Остаток динитротирозина                          Натриевая соль остатка динитротирозина

 

Многие белковые растворы при нагревании вступают в реакцию с азотнокислым раствором ртути (содержащим азотистую кислоту). В ходе ре- акции образуются ртутные соли нитропроизводных фенолов и содержащих фенольные группы соединений, имеющие малиновую окраску:

 

L–НN–СН–СО–L                                              L–НN–СН–СО–L

|                                                                             |

СН2                                                                       СН2

 

+  HNO3 + HgNO3                                               + 2H2O

 

O = N                 N = O

|         ||        ||

ОН                                                              OHg   О       O

Остаток тирозина                                             Ртутная соль остатка динитротирозина

 

Это качественная реакция на тирозин. Она была предложена фран- цузским химиком Э. Миллоном в 1849 г. и носит его имя.

В результате нагревания большинства белковых растворов с уксусно- кислым свинцом в щелочной среде выпадает чёрно-бурый осадок сульфида свинца. Данная реакция используется для обнаружения в белках серосодер- жащей аминокислоты — цистеина. Она протекает в несколько этапов. Сна- чала от остатка цистеина отщепляется сульфгидрильная группа и образуется сульфид натрия:

L–НN–СН–СО–L                               L–НN–СН–СО–L

|                                                               |

СН2              + 2NaOH                           СН2               + Na2S + H2O

|                                                               |

SH                                                            OH

Остаток цистеина                                      Остаток серина

 

Ацетат свинца вступает в реакцию со щёлочью и образуется плюмбит натрия:

(CH3COO)2Pb  +   2NaOH             Na2PbO2  +   2CH3COOH

 

Затем сульфид и плюмбит натрия взаимодействуют друг с другом и об- разуется сульфид свинца:

Na2S  +   Na2PbO2  +   2H2O             PbS↓  +   4NaOH

 

Существуют и другие качественные реакции на белки.

 

1.12.   Классификация белков

В настоящее время существует несколько классификаций белков, бази- рующихся на разных критериях. Белки классифицируют и по выполняемым ими функциям, и по источнику получения, и по пищевой ценности, и по форме молекулы, и по растворимости в отдельных растворителях, и по хими- ческому строению, а также по другим признакам.

Однако все существующие классификации белков несовершенны и весьма условны, так как в их основе лежат случайные признаки. Например, при классификации белков по их функциям к какой-либо одной группе нель- зя отнести бифункциональные белки. К тому же функции многих белков ещё не изучены.

По мере возрастания уровня знаний об особенностях структуры белков и связи этой структуры с их биологической функцией данный критерий мо- жет послужить основой для создания рациональной классификации белков. Однако пока это не представляется возможным, т. к. полученные на сего- дняшний день сведения отражают строение лишь очень небольшого числа белков из того их великого множества, которое существует в природе.

Итак, поскольку в настоящее время проблема создания рациональной классификации белков ввиду её сложности еще не решена, традиционно пользуются классификацией белков по их химическому строению и физико- химическим свойствам. Такая систематизация белков оказалась наиболее удачной, хотя она также не базируется на их фундаментальных свойствах. На сегодняшний день эта классификация является наиболее универсальной и общепринятой.

Согласно данной классификации, в зависимости от степени сложности состава белков, их делят на две группы — простые (протеины) и сложные (протеиды). Простые белки состоят только из аминокислот, а сложные белки обязательно содержат в своём составе помимо белковой части ещё какой- либо небелковый компонент.

 

Простые белки классифицируют в зависимости от их растворимости в тех или иных растворителях. Несмотря на условность выбора растворителей, этот вариант классификации удобен, т. к. исследование белков обычно начи- нается с их экстракции (лат. “extrahere” — извлекать) из биологического ма- териала. Обработка испытуемого материала различными растворителями по- зволяет извлечь разные группы белков. Всего различают четыре группы про- стых белков.

Первую группу составляют альбумины (лат. “albumen” — белок) — высокогидратированные белки, хорошо растворимые в воде, а также в вод- ных растворах солей различной концентрации, разбавленных кислотах и ще- лочах. Из водных растворов они легко выпадают в осадок при насыщении раствора солями. Типичными представителями этой группы являются альбу- мин куриного яйца, сывороточный альбумин. К альбуминам также относятся рицин семян клещевины, лейкозин зародыша пшеничного зерна, легумелин семян гороха.

Вторую группу образуют глобулины (лат. “globulus” — шарик) — слабогидратированные белки, растворимые в водных растворах нейтральных солей слабой и умеренной концентраций, а также в разбавленных кислотах и щелочах, но не растворимые в воде. Для извлечения глобулинов из различ- ных объектов чаще всего используют 10%-ный водный раствор NaCl или KCl. Выделить глобулины из солевого раствора можно, воспользовавшись методом диализа, для чего раствор белка наливают в мешочек из полупрони- цаемой плёнки, который помещают в проточную воду. Молекулы соли при этом из мешочка постепенно удаляются, а глобулины в мешочке выпадают в осадок. Альбумины, перешедшие в солевой раствор вместе с глобулинами, при этом остаются в растворе. Особенно много глобулинов в семенах бобо- вых и масличных культур. Среди них наиболее хорошо изучены вицилин се- мян гороха, фазеолин семян фасоли, глицинин семян сои, арахин семян ара- хиса, эдестин плодов конопли и др.

 

В третью группу входят проламины — белки, растворимые в 60–80%- ном водном растворе этилового спирта, слабых кислотах и щелочах, но не растворимые в воде, солевых растворах, а также абсолютном этаноле. Своё название проламины получили вследствие того, что при их гидролизе обра- зуется много пролина. Хорошую растворимость проламинов в этаноле свя- зывают с неполярным характером радикала пролина. Эта группа белков встречается почти исключительно в семенах всех без исключения до сих пор исследованных злаков. Наиболее изучены глиадин пшеницы, секалин ржи, гордеин ячменя, авенин овса, зеин кукурузы и др.

Четвертой группой простых белков являются глютелины (лат. “gluten

  • — клей) — белки, растворимые в слабых (0,1–0,2%-ных) растворах щелочей или кислот и не растворимые в воде, солевых и спиртовых растворах. Эти белки встречаются главным образом в семенах злаков, а также содержатся в зелёных частях растений. Глютелинами, в частности, являются глютенин пшеницы и оризенин риса.

Глиадин пшеницы в комплексе с глютенином формируют клейковину. Её качество определяет мукомольные и хлебопекарные достоинства пшенич- ной муки.

Существуют также простые белки, не растворимые ни в одном из рас- смотренных растворителей. Поэтому они не могут быть отнесены ни к одной из описанных групп и находятся за пределами данной классификации.

Сложные белки классифицируют в зависимости от химической приро- ды присутствующего в их составе небелкового компонента, называемого простетической (греч. “προσθετος” — добавочный) группой.

Если в состав сложных белков входит углеводный компонент, их назы- вают гликопротеидами. Эти белки присутствуют во всех тканях животных и растений и в микроорганизмах. Гликопротеидами являются белки слюны, многие белки крови, структурные белки клеточных мембран, белки некото- рых растительных слизей, запасной белок фасоли, некоторые ферменты и др.

 

Сложные белки, представляющие собой белково-липидные комплексы, называют липопротеидами. Их простетические группы являются липидами. Эти белки широко присутствуют в клетке. Например, они составляют струк- турную основу клеточных мембран, регулирующих поступление веществ в клетку, а также процессы их метаболизма.

Окрашенные белки называют хромопротеидами (греч. “χρώμα” — цвет). Типичным представителем этой группы белков является гемоглобин, имеющий красную окраску, в котором белок глобин связан с простетически- ми группами — четырьмя молекулами гема (рис. 15). Одна молекула гема в качестве небелкового компонента входит также в состав миоглобина. Жёлтой окраской обладают белки флавопротеиды (лат. “flavus” — жёлтый), в своём составе они содержат витамин В2.

CH=CH2             CH3 CH

 

 

H3C

 

CH=CH2

N

 

 

HC                   Fe                    CH

     

N               N

H3C                                                   CH3

 

CH2                      CH2

|                            |

CH2                      CH2

|                            |

CОOH                 CОOH

 

Небелковыми компонентами нуклеопротеидов — важнейшей группы сложных белков — являются нуклеиновые кислоты. Эти белки участвуют в центральных биологических процессах, составляющих основу функциониро- вания всех живых организмов. Нуклеопротеиды в особо больших количест- вах содержатся в клеточных ядрах.

Существуют и другие группы сложных белков.

 

1.13.   Методы выделения и очистки белков

Белки, как известно, являются весьма лабильными соединениями и при неблагоприятных воздействиях могут денатурировать, а следовательно, и ут- ратить свою биологическую функцию. Поэтому при их выделении и очистке необходимо придерживаться ряда общих правил, позволяющих избежать де- натурации выделяемого белка. Во-первых, все процедуры по выделению бел- ков следует вести при температуре как можно более низкой. Во-вторых, в растворы белка рекомендуется добавлять вещества, связывающие ионы тя- жёлых металлов (например, ЭДТА — этилендиаминтетраацетат), а также ве- щества, поддерживающие на низком уровне окислительно-восстановитель- ный потенциал (цистеин, восстановленный глутатион и др.). В-третьих, сле- дует избегать сильного разбавления белковых растворов, так как это может привести к нарушению четвертичной структуры белка. И, в-четвёртых, реак- ция среды в растворах, содержащих белок, не должна быть сильнокислой или сильнощелочной.

В процессе выделения и очистки нужный белок отделяют от множества других содержащихся в клетках или ткани белков и небелковых соединений, исходя из таких его свойств, как размер его молекул, растворимость, изо- электрическая точка, заряд и др. Выделение белка начинается с измельчения (гомогенизации) испытуемого материала (ткани, клеток). Затем проводится экстракция белков таким растворителем, который наиболее полно извлекает нужный белок. Для отделения белков от низкомолекулярных веществ можно использовать метод диализа. Путём осаждения органическими растворите-

 

лями или солями (чаще всего сульфатом аммония) можно получить белковый осадок и затем его высушить лиофильным способом (в вакууме из заморо- женного состояния). Такой белковый препарат содержит смесь различных белков. Если необходимо получить белок в более чистом состоянии, приме- няют один или несколько методов разделения белков: электрофорез, изоэлек- трическую фокусировку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и др.

Электрофорез. Этот метод разделения белков основан на том, что все они являются амфотерными электролитами и содержат положительно и от- рицательно заряженные группировки, количество которых зависит от амино- кислотного состава данного белка. В зависимости от величины и знака сум- марного заряда, а также от размеров и формы молекулы разные белки пере- двигаются в электрическом поле с различной скоростью, на чём и основано их разделение.

Изоэлектрическая фокусировка белков. Этим методом белки разде- ляются на основе различий их изоэлектрических точек. Смесь различных белков наносится на колонку, заполненную амфолинами — смесью поли- аминополикарбоновых кислот, способной в электрическом поле создавать непрерывный градиент pH. При пропускании электрического тока белки пе- редвигаются по колонке до тех пор, пока не попадут в зону pH, соответст- вующую их изоэлектрической точке. Там они останавливаются. Затем полу- чившиеся отдельные фракции белков собираются при их вымывании из ко- лонки.

Гель-фильтрация. Разделение белков при использовании этого метода проводится на основе различий в размерах их молекул. Пробу наносят на ко- лонку, заполненную мелкими пористыми гранулами высокогидратированно- го нерастворимого углеводного полимера — сефадекса. Молекулы белков, имеющие сравнительно небольшие размеры, проникают через поры внутрь этих гранул, в результате чего их прохождение через колонку замедляется,

 

тогда как молекулы более крупных белков не могут проникнуть внутрь гра- нул и проходят через колонку значительно быстрее.

Ионообменная хроматография. Разделение белков в данном случае происходит на основе различий в плотности и знаке их заряда. Если в ней- тральной среде (при pH 7) белок имеет положительный заряд, то он связыва- ется на колонке с ионообменником, содержащим карбоксильные группы (ка- тионообменником), тогда как отрицательно заряженные белки с ионообмен- ником не связываются, а если белок имеет отрицательный заряд, то он связы- вается на колонке с ионообменником, содержащим органические основания (анионообменником), и в этом случае с ионообменником не связываются по- ложительно заряженные белки. Связавшиеся с сорбентом белки снимают с колонки путём их вымывания конкурирующим за место связывания с сор- бентом раствором соли. Те белки, у которых плотность заряда ниже, вымы- ваются с колонки первыми, за ними следуют белки с более высокой плотно- стью заряда.

Аффинная хроматография. Данный метод разделения белков основан на принципе их избирательного взаимодействия со специфическими вещест- вами, закреплёнными на носителе. Через колонку, заполненную сорбентом, пропускают смесь белков. При этом все белки, не взаимодействующие с сор- бентом, проходят через колонку свободно, и только белок, взаимодействую- щий с сорбентом, адсорбируется на колонке и задерживается в ней. Этот ме- тод позволяет отказаться от многостадийных, трудоёмких схем выделения и очистки белков и получать высокоочищенные, однородные фракции белков непосредственно из белковых экстрактов.

Применяя методы разделения белков с целью выделения какого-то од- ного специфического белка из смеси многих белков, необходимо иметь удобный способ контроля, который позволял бы определять эффективность каждой стадии их разделения. Например, при очистке фермента измеряют его каталитическую активность и тем самым отличают от всех других бел-

 

ков. Все операции по выделению и очистке белков контролируют по выходу белка и по его специфической активности.

 

Вопросы для самоконтроля знаний

  1. Назовите функции белков.
  2. Приведите примеры белков, выполняющих транспортную функцию.
  3. В чём биохимическое отличие белков семян от белков вегетативных частей растений?
  4. В каких единицах измеряется молекулярная масса белков?
  5. В каких пределах колеблется молекулярная масса белков?
  6. Приведите пример низкомолекулярного белка.
  7. Охарактеризуйте элементный состав белков пшеницы.
  8. Назовите особенности элементного состава белков.
  9. Назовите цветные реакции на белки и укажите те группы в белке, для которых характерна каждая из реакций.
  10. Напишите общую структурную формулу протеиногенной амино- кислоты, укажите α-углеродный атом.
  11. Напишите реакцию гидролиза белка.
  12. Напишите уравнения ионизации аминокислот в общем виде в силь- нокислой и в сильнощелочной средах.
  13. Напишите диссоциацию глутаминовой кислоты при pH<7,0.
  14. Напишите формулы протеиногенных аминокислот.
  15. Расскажите о классификации протеиногенных аминокислот по R-группе.
  16. Напишите реакцию окисления цистеина.
  17. Расскажите, что Вы знаете о первичном синтезе аминокислот в природе.
  18. Назовите незаменимые аминокислоты.
  19. Расскажите о роли белков в питании человека и животных.
  20. Расскажите о пищевой ценности белков.

 

  1. Охарактеризуйте понятия «химический скор» и «лимитирующие аминокислоты».
  2. Расскажите о способах увеличения производства полноценного белка.
  3. Расскажите о сильных и слабых взаимодействиях в белковой моле-

куле.

  1. Напишите общий  вид   полипептидной  цепи   и   укажите   N-   и

C-концевые аминокислотные остатки.

  1. Расскажите о первичной структуре белка.
  2. Что вы знаете о способах расшифровки первичной структуры бел-

 

ка?

 

 

 

  1. Расскажите о строении инсулина и его функции.
  2. Объясните взаимосвязь первичной структуры белка и его функции.
  3. Расскажите об α-спирали и структуре складчатого слоя.
  4. Что Вы знаете о третичной структуре белка?
  5. Какие силы стабилизируют третичную структуру белков?
  6. На каком уровне структурной организации белковой молекулы

 

формируется её активный центр?

  1. Расскажите о четвертичной структуре белка.
  2. Объясните взаимосвязь третичной и четвертичной структур с био- логической активностью белковой молекулы.
  3. Расскажите о взаимосвязи первичной, вторичной, третичной и чет- вертичной структур белка.
  4. Чем объяснить изменение в свойствах белка куриного яйца при на- гревании?
  5. Что такое денатурация белков?
  6. Какие связи в молекуле белка могут нарушаться при денатурации?
  7. Какими воздействиями можно вызвать денатурацию белковой мо- лекулы?

 

  1. Нарушаются ли при денатурации первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры белковой молекулы?
  2. Какой белок, нативный или денатурированный, имеет бóльшую вязкость в растворе и бóльшую растворимость?
  3. Как отражается процесс денатурации на выполнении белками их специфических функций?
  4. Приведите примеры обратимой и необратимой денатурации белка.
  5. Растворы белка прогревали при 60 °С в одной пробирке 5 минут, в другой — 10 минут. В каком случае денатурация белка будет более глубо- кой?
  6. Какую роль играют процессы денатурации в явлениях живого мира и в пищевой промышленности?
  7. Какие химические группы в молекулах белков могут ионизировать-

ся?

  1. Напишите, как диссоциирует: 1) лизин в сильнокислой среде; 2)

глутаминовая кислота при pH 12.

  1. Что такое изоэлектрическая точка белка?
  2. Изоэлектрическая точка  данного  белка  находится  при  pH 7. Выпадает ли белок в осадок из водного раствора при этом значении pH?
  3. Изоэлектрическая точка данного белка находится при pH 6. При ка- ком значении pH, 7 или 8, растворимость этого белка выше?
  4. По каким признакам можно классифицировать белки?
  5. На какие группы делят белки в зависимости от формы их молекул?
  6. Приведите примеры глобулярных и фибриллярных белков.
  7. Какие функции чаще всего выполняют фибриллярные белки?
  8. Чем отличаются протеиды от протеинов?
  9. Какие принципы лежат в основе классификации протеинов и про- теидов?
  10. Каких простых белков больше всего содержится в семенах бобовых и в плодах злаков?

 

  1. Какие белки участвуют в построении биологических мембран?
  2. К какой группе белков относится гемоглобин?
  3. С какими сложными белками связан процесс реализации наследст- венной информации?
  4. В силу каких причин белки при выделении могут утратить свою биологическую функцию?
  5. Каких правил надо придерживаться при очистке белков, чтобы со- хранить их биологическую функцию?
  6. С каких стандартных процедур начинается выделение белков?
  7. С помощью каких веществ можно осадить белки?
  8. Каким способом лучше производить сушку белковых препаратов?
  9. На различиях в каких свойствах белков основано их разделение ме- тодом электрофореза, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии?
  10. По каким показателям обычно контролируют отдельные стадии и конечный результат выделения и очистки белков?

 

II.    НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты были открыты в 1869 г. молодым швейцарским патологоанатомом И. Ф. Мишером. Изучая химический состав гноя, он вы- делил из ядер присутствующих в нём погибших белых клеток крови (лейко- цитов) новое неизвестное вещество, которое назвал нуклеином (лат. “nucleus” — ядро). Окончание «-ин» в названии показывало, что это вещест- во содержит азот, подобно белкам, или протеинам. Однако оно не разруша- лось под воздействием ферментов гидролиза белков — протеаз. Это вещест- во содержало также фосфор. Нуклеину была присвоена эмпирическая фор- мула C29H49N9O22P3, однако в дальнейшем она не подтвердилась.

Термин нуклеиновые кислоты был предложен в 1889 г. немецким учёным Р. Альтманом. В этом названии нашло отражение то, что данные ве- щества проявляют кислотные свойства.

Впоследствии нуклеиновые кислоты были обнаружены не только в яд- рах, но и в цитоплазме клеток всех живых организмов.

 

2.1.   Химический состав нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты являются многоосновными. Они хорошо раство- ряются в щелочах и осаждаются из растворов при подкислении.

Для полного химического расщепления нуклеиновых кислот обычно применяют кислотный гидролиз в жёстких условиях. С этой целью исполь- зуют кипячение либо в 70%-ной хлорной кислоте при 100 °С в течение часа, либо в 100%-ной муравьиной кислоте при 175 °С в течение двух часов.

При полном гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на азоти- стые основания, углеводы и молекулы фосфорной кислоты:

полный гидролиз

Нуклеиновые                                  Азотистые + Углеводы + n Н3РО4 кислоты                                                    основания

Азотистые основания. В составе нуклеиновых кислот содержатся ос- татки азотистых оснований двух типов: производные пиримидина и произ-

 

водные пурина. Пиримидин и пурин — это азотсодержащие ароматические гетероциклические соединения, проявляющие свойства слабых оснований. Пурин представляет собой продукт конденсации пиримидина с другим азот- содержащим ароматическим гетероциклом — имидазолом:

 

N 3      4        5

 

 

 

2                 6

1

N

Пиримидин

 

 

 
   

N                  H

Пурин

 

 

В продуктах полного гидролиза нуклеиновых кислот присутствуют главным образом следующие оксо- и аминопроизводные пиримидина и пу- рина:

 

 

NH2                                   O                                 O HN 3  4              5              HN 3                       4       5

 

 

CH3

 

6                                     2                 6

1

O                                       O           N                   O          N

H                                       H                                 H

2-Оксо-4-амино-                   2,4-Диоксо-              2,4-Диоксо-5-метил- пиримидин (Цитозин)       пиримидин (Урацил)      пиримидин (Тимин)

NH2                                                          O

 

       
   
     
 

 

                                                                                                           

N                   H                        H2N          N                  H

6-Аминопурин (Аденин)              2-Амино-6-оксопурин (Гуанин)

 

Открытие большинства азотистых оснований, остатки которых присут- ствуют в составе нуклеиновых кислот, связано с именем немецкого химика

 

А. Косселя. В 1879 г. он открыл в нуклеине соединение жёлтого цвета, кото- рое оказалось гуанином — веществом, впервые выделенным в 1858 г. другим немецким химиком А. Ф. Л. Штреккером из перуанского гуано — разложив- шегося в условиях сухого климата помёта морских птиц. Затем Коссель вы- делил из клеток тимуса (зобной железы) телёнка тимин, цитозин (греч. “κύτος” — клетка) и аденин (греч. ἀδήν” — железа). Урацил был открыт в 1900 г. итальянским учёным А. Асколи в составе нуклеиновой кислоты дрожжей и получил своё название как производное мочевой кислоты (лат. “acidum uricum” — мочевая кислота).

Тимин по своему химическому строению близок к урацилу и отличает- ся от него наличием вместо атома водорода в положении С-5 метильной группы. Поэтому тимин имеет второе название — 5-метилурацил.

Входящие в состав нуклеиновых кислот азотистые основания принято обозначать сокращённо заглавными русскими либо латинскими начальными буквами их тривиальных наименований: аденин — А, гуанин — Г или G, ци- тозин — Ц или C, урацил — У или U, тимин — Т.

Важной особенностью азотистых оснований, участвующих в построе- нии нуклеиновых кислот, является их способность образовывать друг с дру- гом строго определённые пары. Так, аденин может образовывать пару, со- единяясь двумя водородными связями с тимином — А ׃׃׃ Т или с родствен- ным тимину урацилом — А ׃׃׃ У, а гуанин может образовывать пару с цито- зином, соединяясь с ним тремя водородными связями — Г MMM Ц (рис. 16).

Способность азотистых оснований образовывать строго определённые пары обусловлена их комплементарностью (лат. “complementum” — допол- нение), т. е. взаимным структурным соответствием, обеспечивающим доста- точно близкое для образования водородных связей пространственное распо- ложение их химических группировок.

Таким образом, аденин комплементарен тимину (либо урацилу), а гуа- нин — цитозину, т. е. в паре всегда присутствует одно пуриновое и одно пи-

римидиновое основание. Данные пары азотистых оснований называют кано-

 

H

|

N                N    H · · · O               CH3

 

 

N                         N · · · H N

 

N

 

O

Остаток аденина             Остаток тимина

H

|

N                 О · · · H   N

 

 

 

 

N                               H · · · N

 

 

 
   

N H · · · O

| H

Остаток гуанина           Остаток цитозина

 

 

ническими, т. к. их образование энергетически наиболее выгодно и именно они в основном реализуются в нуклеиновых кислотах. Однако в природе иногда встречаются и другие варианты пар, образуемые данными азотистыми основаниями. Такие пары называют неканоническими.

Структурное соответствие азотистых оснований, образующих пары, часто изображают в виде условных геометрических фигур:

 

  • · · · · ·

А                                                Г          · ·

  • · · · · ·

 

Пара А ׃׃׃ Т                                Пара Г MMM Ц

 

Принцип парности (комплементарности) азотистых оснований опреде- ляет важнейшие структурные и функциональные особенности нуклеиновых кислот.

Аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил называют главными азоти- стыми основаниями, т. к. их остатки содержатся в нуклеиновых кислотах в больших количествах. Помимо них в молекулах нуклеиновых кислот в не- больших количествах присутствуют остатки так называемых минорных ос- нований, которые в основном представляют собой метилированные формы главных азотистых оснований (см. рис. 19).

Такие изменённые или необычные остатки азотистых оснований в мо- лекулах нуклеиновых кислот во многих случаях представляют собой специ- фические сигналы, которые играют важную роль в реализации генетической информации или в обеспечении её сохранности.

Углеводные компоненты. Главными углеводными составляющими нуклеиновых кислот являются две близкие по строению пентозы в фураноз- ной форме — β-D-рибоза и 2-дезокси-β-D-рибоза:

 

5                                                                                       5

НОСН2   О       ОН                      НОСН2   О       ОН

 

4        Н       Н    1                                               4        Н       Н    1

Н 3                                                                               2 Н Н 3              2 Н ОН          ОН                                      ОН    Н

β-D-Рибоза                         2-Дезокси-β-D-рибоза

 

По химическому строению 2-дезокси-β-D-рибоза отличается от β-D-ри- бозы только тем, что у неё при втором углеродном атоме вместо группы ОН находится атом водорода. Об этом говорит и приставка «дезокси-» в назва- нии этой пентозы.

Углеводные компоненты впервые выделил из нуклеиновых кислот и идентифицировал американский биохимик российского происхождения Ф. А. Т. Левин. В 1909 г. он установил, что в состав нуклеиновых кислот входит

 

рибоза — углевод, который ещё в 1901 г. был получен немецким химиком Г. Э. Фишером синтетическим путём. Фишер выяснил, что новый углевод по своему строению очень похож на арабинозу, и назвал его рибозой, образовав этот термин путём видоизменения слова «арабиноза». Спустя 20 лет Левин установил, что в составе нуклеиновых кислот присутствует ещё один углевод

  • — 2-дезоксирибоза. За несколько лет до этого её также синтезировал Фишер. Фосфорная кислота. Наконец ещё одним компонентом нуклеиновых кислот является ортофосфорная кислота — H3PO4. О том, что она присутст- вует в продуктах кислотного гидролиза нуклеиновых кислот, впервые сооб-

щил А. Коссель в 1891 г.

Фосфорной кислоте принадлежит исключительно важная роль во всех процессах жизнедеятельности организмов. В биохимии в структурных фор- мулах сложных органических соединений её остатки — фосфатные группы:

 

О

 

О

||

НО–Р–ОН

 

или

||

–О–Р–О

|

 

|

 

часто обозначают символом –è.

 

2.2.   Нуклеозиды и нуклеотиды. Функции нуклеотидов

При частичном гидролитическом расщеплении нуклеиновые кислоты распадаются на нуклеотиды. Следовательно, нуклеиновые кислоты являются полимерами нуклеотидов:

 

частичный гидролиз

Нуклеиновые кислоты                                       Нуклеотиды

 

В свою очередь, каждый нуклеотид построен из азотистого основания, углеводного компонента и фосфорной кислоты.

Азотистые основания, взаимодействуя с гликозидным гидроксилом уг-

леводного компонента, образуют соединения типа гликозидов, которые по- лучили название нуклеозидов:

 

Азотистое основание  +   Углевод           Нуклеозид

 

 

Главные нуклеозиды, выделяемые из нуклеиновых кислот, представ- ляют собой N-гликозиды. Если они содержат в качестве углеводного компо- нента D-рибозу, их называют рибонуклеозидами, а если 2-дезокси-D-рибозу, то дезоксирибонуклеозидами. Название каждого нуклеозида производят от названия входящего в его состав азотистого основания.

Пять разных азотистых оснований, соединяясь с рибозой, могут обра- зовывать пять рибонуклеозидов:

 

Аденин   +   Рибоза           Аденозин Гуанин  +   Рибоза           Гуанозин

Цитозин  +   Рибоза            Цитидин

 

Урацил  +   Рибоза            Уридин

 

Тимин   +   Рибоза             Тимидин

 

 

Аналогично при взаимодействии азотистых оснований с дезоксирибо- зой могут образовываться пять дезоксирибонуклеозидов: дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин, дезоксиуридин и дезокситимидин.

Таким образом, возможно существование 10 различных нуклеозидов. Однако в природе широко распространены только восемь из них, а два нук- леозида — тимидин и дезоксиуридин присутствуют в клетках в очень малых количествах.

Установлено, что главные природные нуклеозиды образуются при уча- стии N-1 пиримидиновых оснований или N-9 пуриновых оснований и имеют β-конфигурацию гликозидной связи, например:

 

NH2                                                                  NH2

 

 
   

 

 

N

 

5′

НОСН2   О

4′        Н       Н

 

N-гликозидные      О          N связи

5′

НОСН2   О

1′                                              4′        Н       Н     1′

 

Н 3′

 

2′ Н                              Н3′

 

2′ Н

 

ОН    ОН                                      ОН    Н

Аденозин                              Дезоксицитидин

 

Таким образом, главные нуклеозиды отличаются друг от друга тем, ка- кое азотистое основание и какой углевод входят в их состав.

При нумерации атомов в нуклеозидах во избежание путаницы атомы углерода углеводных остатков обозначают номерами со штрихом в отличие от номеров атомов остатков азотистых оснований.

Нуклеотиды — мономерные единицы нуклеиновых кислот, представ- ляют собой фосфорные эфиры нуклеозидов:

 

Нуклеозид  +   Н3РО4           Нуклеотид

 

Из рибонуклеозидов образуются соответствующие рибонуклеотиды, а из дезоксирибонуклеозидов — соответствующие дезоксирибонуклеотиды. Номенклатура главных природных нуклеотидов приведена в таблице 3.

Остаток молекулы фосфорной кислоты при образовании нуклеотида может замещать атом водорода у пятого углеродного атома (С-5′) в остатке рибозы или дезоксирибозы. При этом образуется нуклеозид-5′-монофосфат (НМФ), например:

 

Таблица 3 Номенклатура и краткие обозначения главных нуклеотидов

Азотистое основание

 

Нуклеозид

Нуклеотид (нуклеозидмонофосфат, НМФ)

полное название

краткое обо-

значение

Аденин

Аденозин

Аденозинмонофосфат (адениловая кислота) Дезоксиаденозинмонофосфат (дезоксиадениловая кислота) Гуанозинмонофосфат (гуаниловая кислота) Дезоксигуанозинмонофосфат (дезоксигуаниловая кислота) Цитидинмонофосфат (цитидиловая кислота) Дезоксицитидинмонофосфат (дезоксицитидиловая кислота) Уридинмонофосфат (уридиловая кислота) Дезокситимидинмонофосфат

(дезокситимидиловая кислота)

АМФ

 

Дезоксиаденозин

дАМФ

Гуанин

Гуанозин

ГМФ

 

Дезоксигуанозин

дГМФ

Цитозин

Цитидин

ЦМФ

 

Дезоксицитидин

дЦМФ

Урацил

Уридин

УМФ

Тимин

Дезокситимидин

дТМФ

 

NH2                                                                  NH2

 

 
   

 

N                                                         О

O                                                 O

 

||        5

HO–P–О–СН2  О

|

HO     4′     Н       Н

 

||        5

НО–P–О–СН2  О

|

1′                            HO     4′        Н       Н    1′

 

Н 3′

 

2′ Н                              Н3′

 

2′ Н

 

ОН    ОН                                      ОН    Н

Аденозин-5′-монофосфат         Дезоксицитидин-5′-монофосфат (АМФ)                                            (дЦМФ)

 

Нуклеотиды выполняют в клетке ряд важнейших биологических функ- ций. Во-первых, продуктами полимеризации нуклеотидов являются нуклеи- новые кислоты. Во-вторых, нуклеотиды входят в состав некоторых фермен- тов в качестве коферментов. В-третьих, из нуклеотидов образуются фосфор- ные производные, играющие важную роль в обеспечении клетки энергией.

 

2.3.   Фосфорные производные нуклеотидов

Живые организмы нуждаются в постоянном притоке свободной энер- гии, которая расходуется на процессы биосинтеза сложных органических со- единений, на транспорт молекул и ионов, на выполнение механической рабо- ты, например, мышечного сокращения, и другие цели.

Клетка может использовать в качестве источника энергии энергию хи- мических связей. Известно, что энергетический уровень химических связей неодинаков. Химические связи с высоким уровнем энергии называют высо- коэнергетическими, или макроэргическими (греч. “μακρός” — большой + ἔργον” — работа), и обозначают знаком ~ (тильда).

Разрыв высокоэнергетической связи сопровождается освобождением большего количества энергии, чем разрыв обычной ковалентной связи. Та- ким образом, соединения с высокоэнергетическими связями играют в клетке роль своеобразных аккумуляторов энергии.

Известен целый ряд соединений с высокоэнергетическими связями. К их числу относятся и фосфорные производные нуклеотидов, которые обра- зуются путём последовательного присоединения к нуклеотиду одного или двух остатков фосфорной кислоты. При этом образуются соответственно нуклеозиддифосфаты (НДФ) и нуклеозидтрифосфаты (НТФ). Номенклатура фосфорных производных нуклеотидов представлена в таблице 4.

Среди всех НДФ и НТФ особое место занимают производные адено- зинмонофосфата (АМФ). Если этот нуклеотид присоединяет к своему фос- фатному остатку ещё один остаток фосфорной кислоты, то образуется адено-

зиндифосфат (АДФ), а если два остатка, то аденозинтрифосфат (АТФ):

 

Таблица 4 Номенклатура и краткие обозначения фосфорных производных нуклеотидов

Нуклеотид,

НМФ

Нуклеозиддифосфат,

НДФ

Нуклеозидтрифосфат,

НТФ

АМФ дАМФ

 

ГМФ дГМФ

 

ЦМФ дЦМФ

дТМФ УМФ

Аденозиндифосфат, АДФ Дезоксиаденозиндифосфат, дАДФ

Гуанозиндифосфат, ГДФ Дезоксигуанозиндифосфат, дГДФ

Цитидиндифосфат, ЦДФ Дезоксицитидиндифосфат, дЦДФ

Дезокситимидиндифосфат, дТДФ

Уридиндифосфат, УДФ

Аденозинтрифосфат, АТФ Дезоксиаденозинтрифосфат, дАТФ

Гуанозинтрифосфат, ГТФ Дезоксигуанозинтрифосфат, дГТФ

Цитидинтрифосфат, ЦТФ Дезоксицитидинтрифосфат, дЦТФ

Дезокситимидинтрифосфат, дТТФ

Уридинтрифосфат, УТФ

NH2

 

макроэргические                     N 1     6    5           7 N

(фосфоангидридные)                                                8

связи                                   2      3    4            9 N N

O         O         O

||           ||          ||           5

HO – P ~ О – Р ~ О – P – О – СН2 О

|           |            |

HO      HO       HO         4′     Н       Н    1′

Н3′            2′ Н

высокоэнергетические                   ОН     ОН фосфатные группы

Остаток аденозин-5′-монофосфата (АМФ) Остаток аденозин-5′-дифосфата (АДФ)

Аденозин-5′-трифосфат (АТФ)

Молекулу АТФ можно рассматривать как заряженную форму аккуму- лятора. В ней содержатся две высокоэнергетические связи, при гидролизе

 

каждой из которых освобождается 7,3 ккал/моль энергии (для сравнения при гидролизе немакроэргической фосфатной связи уменьшение свободной энер- гии составляет приблизительно 2–3 ккал/моль), при этом АТФ превращается в АДФ или АМФ:

+ Н2О                  + Н2О

АТФ                    АДФ                    АМФ

– Н3РО4               – Н3РО4

Освобождающаяся при расщеплении АТФ энергия расходуется клеткой на выполнение какой-либо химической работы: на биосинтез веществ или другие процессы, требующие энергетических затрат. АДФ и АМФ можно рассматривать как разряженные формы аккумулятора.

При расщеплении клеточного топлива, прежде всего углеводов, в про- цессах дыхания или брожения (процессах диссимиляции) часть энергии, со- держащейся в этом топливе, используется на синтез АТФ из АДФ и фосфор- ной кислоты. Происходит зарядка аккумулятора.

Энергия, аккумулированная в клетке в АТФ, непрерывно расходуется, например, на процессы биосинтеза (процессы ассимиляции), и её расход также непрерывно восполняется новым синтезом АТФ за счёт энергии, осво- бождающейся в процессах диссимиляции.

Тем самым в клетке устанавливается важнейшая взаимосвязь двух ти- пов обменных процессов, имеющих противоположную направленность, — ассимиляции и диссимиляции:

при ассимиляции

АТФ   +   Н2О                                        АДФ   +   Н3РО4

при диссимиляции

 

Все другие НТФ, также как и АТФ, содержат высокоэнергетические связи и выступают в роли аккумуляторов энергии. Однако АТФ в клетке иг- рает роль главного, универсального аккумулятора энергии, т. к. энергия, не- обходимая для её «зарядки», поставляется непосредственно в процессах дис- симиляции (у зелёных растений также в процессе фотосинтеза). В ходе дис-

симиляции энергия  химических связей  распадающихся  веществ  (при фото-

 

синтезе — световая энергия) запасается непосредственно в макроэргических связях АТФ.

Остальные НТФ тоже участвуют в процессах ассимиляции. Например, УТФ обеспечивает энергией процесс биосинтеза сахарозы  в  растениях,  ГТФ — клетчатки, ЦТФ — фосфолипидов. Однако все они играют вспомога- тельную роль, являются вторичными источниками энергии, т. к. образуются за счёт высокоэнергетических фосфатных групп АТФ по следующей схеме:

АТФ  +   НМФ              АДФ   +   НДФ

АТФ   +   НДФ              АДФ   +   НТФ

Например, образование уридинтрифосфата протекает следующим образом: АТФ  +   УМФ              АДФ   +   УДФ

АТФ   +   УДФ              АДФ   +   УТФ

Таким образом, АТФ является не только универсальным аккумулято- ром, но и первичным источником энергии в клетке. Это — энергетическая

«валюта» клетки.

2.4.   Общая характеристика нуклеиновых кислот

В природе встречаются два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеино- вые кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК). Они раз- личаются нуклеотидным составом. Как следует из названий типов нуклеино- вых кислот, углеводным компонентом РНК является рибоза, а ДНК — дезок- сирибоза. В составе РНК встречаются четыре основных азотистых основания

  • — аденин, гуанин, цитозин и урацил. Нуклеотиды, образующие ДНК, также содержат четыре основных азотистых основания — аденин, гуанин, цитозин и тимин.

Молекулы РНК и ДНК различаются и по размерам. Молекулярная мас- са РНК варьирует от 2·104 до нескольких миллионов дальтон. Однако по сво- им размерам молекулы РНК значительно уступают молекулам ДНК. Лишь у

мелких вирусов молекулярная масса ДНК составляет несколько миллионов

 

дальтон. У кишечной палочки Escherichia coli она составляет 2,5·109 Да и имеет длину 1,4 мм, а у высших организмов может иметь и большую молеку- лярную массу — до 1010–1011 Да. Таким образом, нуклеиновые кислоты в ос- новном — это природные молекулы-гиганты. Некоторые из них можно ви- деть в электронный микроскоп.

Молекулы РНК и ДНК имеют различную локализацию в клетке. РНК присутствуют как в ядре клетки, так и в цитоплазме, а ДНК сосредоточено в ядре, а также имеется в митохондриях и пластидах.

Различия между РНК и ДНК перечислены в табл. 5.

Таблица 5

Различия между РНК и ДНК

 

Тип нуклеино-

вой кислоты

Углевод

Азотистые

основания

Молекулярная

масса, Да

Локализация

в клетке

 

РНК

 

Рибоза

Аденин Гуанин Цитозин

Урацил

От 2·104

до нескольких миллионов

 

Ядро и цитоплазма

 

ДНК

 

Дезокси- рибоза

Аденин Гуанин Цитозин

Тимин

От нескольких миллионов до 1010–1011

Ядро, митохондрии, пластиды

 

Молекулы нуклеиновых кислот всех живых организмов представляют собой длинные полинуклеотидные цепи, в которых нуклеотидные остатки соединены между собой 3′,5′-фосфодиэфирными связями. При образовании этой связи 5′-фосфат одного нуклеотида соединяется с 3′-гидроксилом остат- ка углевода следующего нуклеотида. В результате полинуклеотидная цепь оказывается полярной: на одном её конце остаётся свободной 5′–О–è груп- па, а на другом — 3′–ОН группа.

Конец полинуклеотидной цепи со свободной 5′–О–è группой считают началом цепи и называют 5′-концом. Противоположный конец полинуклео- тидной цепи со свободной 3′–ОН группой считают окончанием цепи и назы-

вают 3′-концом.

 

Остов нуклеиновых кислот имеет одинаковое строение по всей длине молекулы и состоит из остатков чередующихся групп (– пентоза – фосфат – пентоза –), а остатки азотистых оснований в полинуклеотидных цепях служат вариабельными группами:

M

5′-конец        | HO–P=O

| O

Азотистое основание

 

1′

 

 

5′ |

СН2   О

 

4′        Н       Н

Н 3′            2′ Н

О       ОН(Н)

3′,5′-фосфо-              | диэфирная        HO–P=O

связь                     |

O

Азотистое основание

 

|

 

5′ СН2   О

 

4′        Н       Н     1′

Н 3′            2′ Н

 

вариабельные группы

 

О       ОН(Н)

3′,5′-фосфо-              | диэфирная       HO–P=O

связь                    |

O

Азотистое основание

 

|

5′ СН2   О

 

4′        Н       Н     1′

Н 3′            2′ Н

О       ОН(Н)

3′-конец    |

M

Именно последовательностью азотистых оснований определяется уни- кальность структуры и функциональная индивидуальность молекул РНК и ДНК.

 

2.5.   Виды и структура рибонуклеиновых кислот

Содержащиеся в клетке молекулы РНК различаются количеством и по- следовательностью расположения нуклеотидных остатков, пространственной структурой, функциями и локализацией.

В цитоплазме клеток содержатся три вида РНК. Это матричные, или информационные, РНК (мРНК, или иРНК), рибосомальные РНК (рРНК) и транспортные РНК (тРНК).

Матричные РНК имеют молекулярные массы от 150000 до 5000000 дальтон. Они служат матрицами для синтеза белков на рибосомах. На долю мРНК приходится около 5 % всех РНК клетки.

Рибосомальные РНК играют роль структурных компонентов рибосом. Их молекулярные массы варьируют от 35000 до 1700000 дальтон. На долю рРНК приходится более 80 % от всех видов РНК.

Транспортные РНК осуществляют транспорт аминокислот к месту синтеза белка — рибосомам. Молекулярные массы этих РНК относительно невелики и составляют 17000–35000 дальтон. На долю тРНК приходится около 15 % всех РНК клетки.

В клеточном ядре содержится ядерная РНК, которая представляет со- бой молекулы высокомолекулярных предшественников мРНК, рРНК и тРНК. Она составляет 4–10 % всех клеточных РНК.

У некоторых вирусов РНК является основным генетическим материа-

лом.

Рибонуклеиновые кислоты имеют несколько уровней структурной ор-

ганизации.

Первичная структура РНК. Данная структура представляет собой по- рядок чередования нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи. Все виды РНК (мРНК, рРНК, тРНК) являются одноцепочечными полимерами, мономерными звеньями которых являются остатки нуклеотидов. Лишь неко- торые вирусы содержат двухцепочечные РНК. Строятся РНК из нуклеотид-

 

M                                                               NH2

5′          |

HO–P=O

|                  N                          N

O

5′ |

СН2   О       N

N

4′        Н       Н     1′

 

Н 3′

 

2′ Н

О       ОН                         O

 

           |           HO–P=O

|                  N

O

|

5′ СН2   О       N

 

4′        Н       Н     1′

Н 3′            2′ Н

О       ОН   NH2

          |           HO–P=O

|                         N

O

|

5′ СН2   О       N            О

4′        Н       Н    1′

Н 3′            2′ Н

О       ОН  O

          |           HO–P=O

|                         NH

O

|

5′ СН2   О      N

 

4′        Н       Н    1′

Н 3′            2′ Н

О       ОН

3′                           |

M

 

 

NH

 

 

 

N            NH2

 

 

остатки нуклеотидов

 

 

 

О

 

ных остатков четырёх типов: АМФ, ГМФ, ЦМФ и УМФ. Их число в молеку- лах РНК варьирует от нескольких десятков до многих тысяч.

Остов молекулы РНК на всём своём протяжении состоит из чередую- щихся остатков рибозы и фосфорной кислоты. Вариабельной последователь- ностью азотистых оснований, т. е. первичной структурой определяются ин- дивидуальные особенности каждой РНК.

 
   


Фрагмент полинуклеотидной цепи РНК представлен на рис. 17. Однако поскольку такая форма записи структуры РНК очень громоздка, её принято изображать в виде схемы (рис. 18). При этом используют сокращённую сим- волику. Горизонтальные линии на схеме соответствуют остаткам рибозы, бу- квы А, Г, Ц, У — остаткам азотистых оснований, диагональные линии с сим- волом è обозначают 3′,5′-фосфодиэфирные связи. На 5′-конце располагается группа 5′-è, а на 3′-конце — группа 3′-ОН.

Рис. 18. Схема фрагмента полинуклеотидной цепи молекулы РНК

 

Существует также сокращённая форма записи полинуклеотидной цепи РНК с использованием однобуквенной символики, когда азотистые основа- ния нуклеотидных остатков РНК последовательно перечисляются в направ- лении от 5′- к 3′-концу, например: 5′–А–Г–Ц–У– ··· –У–А–Ц–Г–3′.

Вторичная структура РНК. Элементы вторичной структуры РНК об- разуются с помощью водородных связей, возникающих между комплемен- тарными остатками азотистых оснований А ׃׃׃ У и Г MMM Ц при складывании

полинуклеотидной цепи на себя. При этом в молекуле РНК могут появляться

 

спирализованные участки с петлями, называемые шпильками, внутренние петли, выпячивания, множественные петли и псевдоузлы. Наличие спирали- зованных участков характерно для всех видов РНК.

На рисунке 19 изображена вторичная структура тРНК пекарских дрожжей, переносящей к рибосомам фенилаланин. Такую форму, получив- шую название «клеверного листа», имеют молекулы всех транспортных РНК.

 

А – А – Г–ОСН3

 

Y                 У                         петли-шпильки

|                          |

А                 Ц–ОСН3

Ψ ׃׃׃ А

|            |

множественная петля          Н3С–Ц MMM Г

|           |

У ׃׃׃ А                   спирали

|           |

Н3С–7Г – Г      Г MMM Ц

|         А  |        |

Ψ                           У             Г MMM Ц       СН3                          Г

Ц             Т                          Ц                      Г–СН3                  А             Г

                           Г – У – Г – У – Ц–СН3               Ц – Г – А – Г                     Г

Г                      MMM    MM   MMM    MM   MMM                     MMM MMM    MM   MMM                      |

Ц – А – Ц – А – Г – А ׃׃׃ У      2Г – Ц – У – Ц                   УН2

Н3С–А             Ц                                      |        |  У  | СН3                 А            УН2

У                                             А ׃׃׃ У       А                                Г

|          |

У ׃׃׃ А

|          |

У ׃׃׃ Г

|          |

Остатки кислот:                                     Ц MMM Г

|           |

2Г-СН3 — N2-метилгуаниловой,           Г MMM Ц       Ц-ОСН3 — 2′-О-метилцитидиловой,

|           |

7Г-СН3 — N7-метилгуаниловой,           Ц MMM Г       Н3С-Г-СН3 — N2,N2-диметилгуаниловой,

|           |

УН2 — 5,6-дигидроуридиловой,

А

è

Ψ — псевдоуридиловой (псевдоуридин —

 

|

 

 

Ц-СН3 — 5-метилцитидиловой,

Ц

 

5-рибофуранозилурацил),

 

|

 

 

А-СН3 — N1-метиладениловой,

Ц

Y — сильно модифицированной гуани-

 

|

 

Г-ОСН3 — 2′-О-метилгуаниловой,

A

ловой (нуклеозид — уайбутозин).

 

|

 

 

НО

 

 

 

Третичная структура РНК. Молекулы РНК складываются с образо- ванием компактной и упорядоченной третичной структуры, которая стабили- зируется различными взаимодействиями, возникающими между спирализо- ванными участками вторичной структуры. При этом могут появляться до- полнительные водородные связи между достаточно удалёнными друг от дру- га нуклеотидными остатками или связи между ОН-группами остатков рибозы и остатками азотистых оснований. Третичная структура РНК может также поддерживаться при помощи ионов металлов, например ионов Mg2+, которые связываются с остатками фосфатных групп и азотистых оснований.

На рисунке 20 показана третичная структура молекулы фенилаланино- вой тРНК пекарских дрожжей. По форме она напоминает букву L. Такая L-образная структура является универсальной для всех тРНК.

 
   

 

 

Только у транспортных РНК третичная структура образуется самостоя- тельно. У рибосомальных и информационных РНК она формируется при взаимодействии с белками с образованием устойчивых комплексов — нук- леопротеидов. Такими нуклеопротеидами являются рибосомы — комплексы рибосомальных РНК с белками и информосомы — комплексы матричных

РНК с белками.

 

2.6.   Структура дезоксирибонуклеиновых кислот

Первичная структура ДНК. Молекулы ДНК в подавляющем боль- шинстве случаев состоят из двух полинуклеотидных цепочек. Исключение составляют лишь одноцепочечные ДНК некоторых вирусов. В построении цепей ДНК принимают участие остатки нуклеотидов четырёх типов: дАМФ, дГМФ, дЦМФ и дТМФ. Таким образом, мономерными звеньями цепей ДНК являются остатки дНМФ, а первичная структура молекулы ДНК представля- ет собой порядок их чередования в каждой полинуклеотидной цепи.

Остов полинуклеотидных цепей молекулы ДНК имеет одинаковое строение на всём протяжении и состоит из чередующихся остатков дезокси- рибозы и фосфорной кислоты, а специфическая последовательность вариа- бельных групп — остатков азотистых оснований определяет её первичную структуру.

Вторичная структура ДНК. Большой вклад в расшифровку структуры молекулы ДНК внесли исследования американского биохимика Э. Чаргаффа, проведённые им в 1945–1951 гг. Он установил, что у разных видов организ- мов нуклеотидный состав ДНК различен, но в тканях организмов одного биологического вида он одинаковый, не меняется с возрастом и не зависит  ни от рациона питания, ни от изменений окружающей среды. Чаргафф также установил, что в любой молекуле ДНК независимо от вида организма число остатков аденина равно числу остатков тимина, а число остатков гуанина равно числу остатков цитозина, т. е. [А] = [Т] и соответственно [Г] = [Ц], из чего следует, что сумма пуриновых оснований в молекуле ДНК равна сумме пиримидиновых оснований, т. е. [А] + [Г] = [Т] + [Ц].

Эти правила, сформулированные Чаргаффом, наряду с данными рент- геноструктурного анализа, позволили американскому биохимику Дж. Д. Уот- сону и английскому биофизику и генетику Ф. Г. К. Крику предположить, что молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, причём в одной её цепи записан план построения другой. В 1953 г. они построили трёхмерную модель пространственной структуры молекулы ДНК.

 

M

5′        |

HO–P=O                             H                                           M

|                                       N–H ··· O       CH3              |                          3′

O                                                                     H       O

5′ |                        N                                        H 2′            3′H

СН2   О                               N ··· H–N                H       H

N                                     N   1′                                 4′

4′        Н       Н     1′                                                       O     5′ CH2

Н 3′             2′ Н            N                 O                                |

О       Н                                                                        O

              |                                                                                                          |

HO–P=O                                                  H                   O=P–OH

|                                         O ··· H–N                           |            O                                               H                            O

|                        N                                        H 2′            3′H 5′ СН2      О                              N–H ··· N               H       H

N                                     N   1′                               4′

4′        Н       Н     1′                                                       O    5′ CH2

Н 3′                              2′ Н    N                                           N–H ··· O     | О             Н      H                                           O

              |                                                                                                         |

HO–P=O                      H                                               O=P–OH

|                                N–H ··· O                                    |           

O                                                                     H       O

|                                                           N      H 2′           3′H

5′ СН2   О                   N ··· H–N                          H        H

N                                      N   1′                                  4′

4′        Н       Н     1′                                                       O    5′ CH2

Н 3′                          2′ Н          O ··· H–N                             N            | О          Н                  H                                   O

              |                                                                                                       |

HO–P=O                                         H                           O=P–OH

|                    CH3     O ··· H–N                                    |           

O                                                                      H       O

|                                                          N      H 2′           3′H

5′ СН2   О                   N–H ··· N                           H       H

N                                      N    1′                                  4′

4′        Н       Н     1′                                                        O    5′ CH2

Н 3′           2′ Н        O                  N                                    | О  Н                          O

3′                         |                                                                                   |

M                                                                                                                                                                                                  O=P–OH

|        5′

M

 

Согласно этой модели две полинуклеотидные цепи молекулы ДНК за- кручены относительно друг друга и вокруг общей оси таким образом, что об- разуют двойную правовитковую спираль, в которой остатки фосфорной ки- слоты и дезоксирибозы располагаются снаружи, а остатки азотистых основа- ний — внутри спирали. При этом полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК располагаются антипараллельно, т. е. напротив 5′-конца одной цепи спира- ли находится 3′-конец другой цепи.

Также согласно модели Уотсона-Крика диаметр двойной спирали ДНК составляет 2 нм, а длина одного витка  одной нити ДНК  (шаг спирали) —  3,4 нм. Число нуклеотидных остатков в одном витке одной нити спирали равно 10. Однако в зависимости от содержания воды и ионной силы окру- жающего раствора конфигурация молекулы ДНК сильно изменяется.

 
   

Модель двойной спирали молекулы ДНК Полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК удерживаются  относительно

друг друга за счёт водородных связей, образующихся в точном соответствии с правилом Э. Чаргаффа между комплементарными остатками пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований: А ׃׃׃ Т и Г MMM Ц (рис. 21). Таким образом,  в  молекуле  ДНК  две  антипараллельные  полинуклеотидные цепи

комплементарны  друг  другу,  т.  е.  п1о2р2ядок  следования  остатков  азотистых

 

плементарны друг другу, т. е. порядок следования остатков азотистых осно- ваний в одной цепи определяет порядок их следования в другой комплемен- тарной цепи (рис. 22). Комплементарные остатки азотистых оснований уло- жены в стопку внутри двойной спирали.

Схематическое изображение комплементарных антипараллельных це- пей молекулы ДНК представлено на рисунке 23. На схеме остатки дезокси- рибозы показаны горизонтальными линиями, остатки азотистых оснований

— буквами А, Г, Ц и Т, а 3′,5′-фосфодиэфирные связи — диагональными ли- ниями с символом è. На 5′-концах располагаются группы 5′-è, а на 3′-кон- цах — группы 3′-ОН.

 


5′

3′

 

Для изображения полинуклеотидных цепей ДНК используется также сокращённая форма записи с применением однобуквенной символики, на- пример:

Цепь 1

5′– А – Г – Ц – Т – Г – Г –А – Т – А – Ц – А – А – Г – Т – Г – А – Ц – Т –3′

MM   MMM   MMM   MM   MMM   MMM MM    MM    MM    MMM   MM    MM   MMM    MM   MMM   MM    MMM   MM

3′– Т – Ц – Г – А – Ц – Ц –Т – А – Т – Г – Т – Т – Ц – А – Ц – Т – Г – А –5′

Цепь 2

 

Как видно, комплементарные цепи ДНК различаются как по последователь- ности нуклеотидов, так и по нуклеотидному составу. В приведённом примере нуклеотидный состав цепи 1 — А6Г5Ц3Т4, а цепи 2 — А4Г3Ц5Т6. При этом со- блюдаются равенства, установленные Чаргаффом.

 

Третичная структура ДНК. Как известно, в ядре каждой диплоидной клетки человека содержится 46 (23 пары) хромосом. Каждая хромосома представляет собой одну молекулу ДНК. Общая длина всех молекул ДНК клетки человека составляет приблизительно 2 м. Они состоят примерно из 3,2 млрд пар нуклеотидных остатков. Так как тело взрослого человека состо- ит приблизительно из 5·1013 клеток, то общая длина всех молекул ДНК чело- веческого организма достигает 1011 км, что значительно превышает расстоя- ние от Земли до Солнца (примерно 1,5·108 км).

Диаметр клеточного ядра обычно равен приблизительно 10 мкм, и для того чтобы в нём могли помещаться такие огромные молекулы ДНК, они должны быть упакованы в очень компактную структуру. Компактизация мо- лекулы ДНК достигается в результате её дополнительного скручивания в су- перспирализованную структуру с помощью разнообразных белков, взаимо- действующих с определёнными последовательностями нуклеотидных остат- ков в структуре ДНК. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином (греч. “χρώμα” — цвет + лат. “tingo” — красить, т. е. окраши- вающимся материалом, т. к. при подготовке к световой микроскопии он лег- ко окрашивается). Таким образом, хроматин представляет собой нуклеопро- теид.

Существует несколько уровней суперспирализации ДНК эукариот  (рис. 24). Сначала молекула ДНК «накручивается» как на катушки на по- верхности, каждая из которых образована восемью молекулами гистоновых белков. Гистоны — основные белки, богатые лизином и аргинином и имею- щие суммарный положительный заряд; они соединяются с ДНК ионными связями. Комплекс восьми гистоновых белков с ДНК является элементарной структурной единицей хроматина, называемой нуклеосомой. В результате образуется цепочка нуклеосом, напоминающая бусы. На одну нуклеосому приходится 1,75 левых сверхвитка двуспиральной молекулы ДНК. На этой стадии суперспирализации линейные размеры ДНК уменьшаются в 6–7 раз. В таком состоянии хроматин находится в период роста клетки.

 

Перед делением клетки цепочка нуклеосом скручивается при помощи гистонового белка в фибриллу, или соленоид (греч. “σωλήνας” — трубка + “είδος” — вид). Структура соленоида напоминает винтовую лестницу, в од- ном его витке содержится 6–7 нуклеосом. В результате линейные размеры ДНК уменьшаются в 40–70 раз.

После этого фибрилла укладывается в петли, которые связываются с остовом, состоящим из негистоновых белков.  При этом примерно каждые  20 петель образуют минидиск. Эта упаковка может быть неравномерной и приводит к уплотнению ДНК в 600–700 раз. При делении клетки большое число минидисков укладывается в стопку, составляя хромосому, и макси- мальное уплотнение ДНК достигает 1,2·104 раз.

Участок двойной спирали ДНК

Цепочка нуклеосом

 

Фибрилла хроматина

 

Петли хромосомы

 

Конденсированный участок хромосомы

 

Хромосома при делении клетки

2 нм

11 нм

30 нм

300 нм

700 нм

1400 нм

 

Плотно упакованная в ядре клетки молекула ДНК находится в ком- плексе с сотнями разнообразных негистоновых белков. Каждый негистоно- вый белок комплементарен определённому участку ДНК. В группу негисто- новых белков входят структурные ядерные белки, множество ферментов и факторов функционирования ДНК.

 

2.7.   Денатурация и гибридизация нуклеиновых кислот

Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С, либо довести его рН до экстремальных значений, то вторичная структура её молекул, которая стаби- лизируется за счёт слабых взаимодействий (водородных и гидрофобных), разрушится и цепи двойной спирали, удерживавшиеся вместе, разойдутся. Этот процесс называют денатурацией ДНК.

Растворы нативных и денатурированных молекул ДНК различаются физическими свойствами. Так, водные растворы нативных молекул ДНК очень вязкие, имеют максимум поглощения электромагнитного излучения в ультрафиолетовой области, обусловленный наличием азотистых оснований, при 260 нм. При расплетании двойной спирали ДНК вязкость её растворов резко падает, а поглощение УФ-света при 260 нм возрастает. Таким образом, за процессом денатурации ДНК можно следить, наблюдая изменение вязко- сти или оптической плотности её раствора. Белки исследованию ДНК не ме- шают, т. к. имеют максимумы поглощения в УФ-области при 190 и 280 нм.

Для каждой ДНК существует свой определённый интервал температур, в котором происходит её денатурация, называемая также плавлением. Тем- пература, при которой в растворе ДНК  денатурирует половина её молекул,  т. е. средняя точка этого интервала, называется точкой плавления ДНК и обозначается Тпл (рис. 25).

Чем больше в молекуле ДНК пар Г MMM Ц, тем выше её точка плавления. У молекул ДНК, богатых парами А ׃׃׃ Т, точка плавления ниже. Связано это с тем, что для разрыва трёх водородных связей в паре Г MMM Ц требуется больше

 

энергии, чем для разрыва двух водородных связей в паре А ׃׃׃ Т. Таким образом, температура плавления любой ДНК служит показателем её нуклеотидного состава.

Степень         100

денатурации, %

50

50             83    100   t, °С

Кривая плавления ДНК

Если молекула ДНК денатурировала не полностью и ещё имеется двухцепочечный участок, на котором цепи продолжают удерживаться от полного расхождения слабыми взаимодействиями, то процесс её денатурации может быть легко обращён. Этого можно достичь приведением температуры и величины рН среды вновь к физиологическим значениям. Тогда расплетён- ные участки двух цепей ДНК самопроизвольно сплетутся, образуя исходную двойную спираль. Процесс восстановления денатурированной молекулой ДНК исходной структуры называется ренатурацией ДНК.

Однако если произошло полное расхождение цепей ДНК, то ренатура- ция протекает в два этапа. На первом из них водный раствор, содержащий денатурированную ДНК, следует очень медленно охлаждать, поскольку ком- плементарные участки обеих цепей должны «отыскать» друг друга в ходе хаотичного движения и случайных столкновений и образовать короткие уча- стки двойной спирали. Второй этап ренатурации ДНК осуществляется гораз- до быстрее, т. к. остатки остальных азотистых оснований последовательно состыковываются и образуют комплементарные пары. Затем обе цепи «застё- гиваются» наподобие молнии и двойная спираль ДНК полностью восстанав- ливается. При быстром охлаждении раствора с полностью денатурированной

ДНК её ренатурации не происходит.

 

На явлении денатурации и ренатурации основан метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Если смешать растворы ДНК, выделен- ных из организмов разных видов (ДНК1 и ДНК2), полученную смесь нагреть выше температуры плавления этих ДНК, а затем медленно охладить, то сна- чала произойдёт денатурация молекул ДНК смеси, а при последующей рена- турации в растворе образуются двуспиральные структуры. При этом получа- ются не только исходные ДНК1 и ДНК2, но и гибридные молекулы, содержа- щие одну цепь из ДНК1, а другую — из ДНК2. В таких гибридных молекулах присутствуют как спирализованные области,  так  и  неспирализованные (рис. 26). В спирализованных участках полинуклеотидные цепи ДНК ком- плементарны друг другу, а в неспирализованных — не комплементарны.

 

нагревание выше точки плавления

 

ДНК1     ДНК2                    Денатурированные ДНК Гибрид ДНК1–ДНК2 Рис. 26. Гибридизация ДНК

Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот можно оп- ределить проценты сходства и различия между первичными структурами разных образцов нуклеиновых кислот, например между молекулами ДНК, выделенными из организмов разных видов, а также установить идентичность ДНК всех органов и тканей одного организма.

Чем больше процент сходства между цепями ДНК двух биологических видов, образующими гибридные молекулы, тем ближе эволюционное родст- во этих видов организмов. Так, например, процент сходства между ДНК че-

ловека и мыши выше, чем между ДНК человека и дрожжей.

 

Молекулярная гибридизация может быть осуществлена не только меж- ду цепями ДНК, но и между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот, на- пример между цепями ДНК и РНК, при условии, что они содержат компле- ментарные последовательности нуклеотидных остатков. Так, гибридизацией молекул ДНК и РНК впервые было установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки.

 

2.8.   Функции нуклеиновых кислот

Экспериментально было доказано на самых простых биологических объектах — вирусах, что нуклеиновые кислоты в клетке контролируют син- тез белков.

Вирусы (лат. “virus” — яд) являются внутриклеточными паразитами. Они не способны размножаться самостоятельно вне поражённых ими клеток животных, растений, микроорганизмов. По химической природе простейшие вирусы — нуклеопротеиды. Они состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, защищающей нуклеиновую кислоту.

Современная техника работы с вирусами позволяет разложить их на составляющие компоненты — нуклеиновую кислоту и белок и вновь восста- новить структуру вируса из нуклеиновой кислоты и белка, т. е. реконструи- ровать вирус:

 

разложение вируса                    реконструкция вируса

НК–Б                                    НК   +   Б                                          НК–Б

вирус                                   составные                                          вирус части вируса

 

Реконструированный вирус полностью сохраняет свои свойства и в том числе способность поражать живые клетки и размножаться в них.

Подобные опыты, проведённые на двух родственных, но имеющих чёт- кие отличительные признаки вирусах, позволили получить в результате ре- конструкции смешанный вирус, состоящий из нуклеиновой кислоты одного вируса и белка второго вируса, по схеме:

 

НК1–Б1                     НК1   +   Б1

 

НК2–Б2                     НК2

 

 

НК1–Б2

 

 

Изучение потомства смешанных вирусов показало, что оно было иден- тично вирусу, которому принадлежала нуклеиновая кислота:

 

размножение в клетке

НК1–Б2                                           НК1–Б1

Таким образом, природа вирусного белка вновь образующихся вирусов однозначно определяется нуклеиновой кислотой вируса.

На рисунке 27 представлен цикл развития бактериофага (вируса, пора- жающего бактерии). Как видно, вирусная инфекция имеет очень важную особенность: в клетку проникает только вирусная нуклеиновая кислота, а белковый чехол остаётся снаружи.

 

Инфекционная фаза

Вегетативная фаза

 

Поражённая вирусом клетка начинает выполнять программу, закодиро- ванную в нуклеиновой кислоте вируса. Ресурсы клетки используются для об- разования новых вирусных частиц. При этом каждая вновь образовавшаяся вирусная нуклеиновая кислота одевается в белковую оболочку, построенную из вирусного белка, синтезированного поражённой клеткой.

Отсюда следует, что нуклеиновая кислота вируса содержит необходи- мую информацию для синтеза вирусного белка.

В клетках живых организмов нуклеиновые кислоты выполняют функ- ции хранения, наследования и реализации генетической информации.

 

2.9.   Хранение генетической информации

Как известно, индивидуальность любой молекулы белка или нуклеино- вой кислоты определяется её первичной структурой. Уникальность белковой молекулы определяется последовательностью соединения аминокислотных остатков в полипептидной цепочке. Своеобразие каждой молекулы нуклеи- новой кислоты определяется уникальной последовательностью её боковых радикалов — остатков азотистых оснований А, Г, Ц, Т в молекулах ДНК и А, Г, Ц, У в молекулах РНК, т. к. главная цепь валентностей этих полимерных соединений представляет собой регулярно чередующиеся остатки углевода и фосфорной кислоты.

Таким образом, информация о последовательности аминокислотных остатков в полипептидных цепочках белковых молекул должна быть записа- на в первичной структуре ДНК или РНК, а именно в последовательности ос- татков азотистых оснований.

Поскольку в построении белков принимает участие 20 протеиногенных аминокислот, а информация о порядке чередования их остатков в полипеп- тидных цепях должна быть записана на языке нуклеиновых кислот, алфавит которых содержит всего 4 буквы (4 разных остатка азотистых оснований), то каждая аминокислота не может быть закодирована только одним нуклеоти- дом. Ведь если бы одной аминокислоте соответствовал только один нуклео- тид, то можно было бы зашифровать лишь четыре аминокислоты (41 = 4).

 

Следовательно, каждая аминокислота должна кодироваться не одним нуклеотидом, а сочетанием нескольких нуклеотидов. Элементарный матема- тический подсчёт показывает, что каждую из 20 протеиногенных аминокис- лот нельзя закодировать и с помощью двух нуклеотидов, т. к. при сочетании четырёх азотистых оснований по два можно составить лишь 16 комбинаций (42 = 16), что меньше 20. Минимальное количество нуклеотидов, способное кодировать любую из 20 протеиногенных аминокислот, равно трём, т. к. чис- ло сочетаний из четырёх по три равно 64 (43 = 64).

Нуклеотидно-аминокислотный код, т. е. способ записи информации о первичной структуре белков в нуклеиновых кислотах был полностью рас- шифрован к 1965 г. и получил название генетического, или биологического, кода. Он записывается на языке мРНК (табл. 6), т. е. с помощью букв, обо- значающих названия азотистых оснований, входящих в состав мРНК, и обла- дает рядом характерных свойств.

Таблица 6

Стандартный генетический код

 

 

Второй нуклеотидный остаток

 

У

Ц

А

Г

Первый нуклеотидный остаток

 

У

УУУ УУЦ

УУА УУГ

Фен

 

Лей

УЦУ УЦЦ

УЦА УЦГ

 

Сер

УАУ УАЦ

УАА УАГ

Тир

стоп стоп

УГУ УГЦ

УГА УГГ

Цис

стоп Три

У Ц

А Г

Третий нуклеотидный остаток

 

Ц

ЦУУ ЦУЦ ЦУА

ЦУГ

 

Лей

ЦЦУ ЦЦЦ ЦЦА

ЦЦГ

 

Про

ЦАУ ЦАЦ ЦАА

ЦАГ

Гис

 

Глн

ЦГУ ЦГЦ ЦГА

ЦГГ

 

Арг

У Ц А

Г

 

А

АУУ АУЦ АУА

АУГ

Иле Мет

АЦУ АЦЦ АЦА

АЦГ

 

Тре

ААУ ААЦ ААА

ААГ

Асн

 

Лиз

АГУ АГЦ АГА

АГГ

Сер

 

Арг

У Ц А

Г

 

Г

ГУУ ГУЦ ГУА

ГУГ

 

Вал

ГЦУ ГЦЦ ГЦА

ГЦГ

 

Ала

ГАУ ГАЦ ГАА

ГАГ

Асп

 

Глу

ГГУ ГГЦ ГГА

ГГГ

 

Гли

У Ц А

Г

 

2.9.1.   Свойства генетического кода

Стандартный генетический код характеризуется триплетностью, выро- жденностью, специфичностью, непрерывностью, неперекрываемостью и универсальностью.

Триплетность. Определённое сочетание трёх нуклеотидных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, являющееся единицей генетического кода, называется триплетом, или кодоном.

Например, если один из фрагментов полинуклеотидной цепочки в мо- лекуле мРНК имеет следующую последовательность нуклеотидных остатков или триплетов:

УУУ – ГУУ – ААЦ – ЦАГ – ЦАЦ – ЦУА – УГЦ –···, 1           2          3          4         5          6         7

то этой последовательности триплетов соответствует определённая последо- вательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи:

Фен – Вал – Асн – Глн – Гис – Лей – Цис –···

1        2       3        4       5        6        7

 

Вся генетическая информация клетки хранится в ДНК. Фрагмент моле- кулы ДНК, в котором записана информация о первичной структуре одного белка (одной полипептидной цепочки), называется структурным геном (греч. “γένος” — род, происхождение). Поскольку одна полипептидная цепь может содержать от 50 до 2000 (и даже больше) аминокислотных остатков, ген, кодирующий такую полипептидную цепь, должен состоять соответст- венно из 150–6000 (и больше) нуклеотидных остатков.

Микробная клетка кишечной палочки E. coli содержит одну молекулу ДНК, в которой зашифрована первичная структура нескольких тысяч белков, обеспечивающих жизнеспособность клетки. Следовательно, в гигантской молекуле ДНК E. coli расположены несколько тысяч генов, каждый из кото- рых несёт информацию об одном из белков, синтезируемых клеткой. В ДНК человека содержится приблизительно 20,5 тыс. структурных генов.

 

Однако на гены приходится только 3 % от всей длины ДНК. Функции остальных 97 % этой нуклеиновой кислоты пока не выяснены.

Вырожденность. В ходе расшифровки генетического кода было уста- новлено, что из 64 возможных триплетов смысловое значение имеет только

  1. Эти триплеты получили название значащих. Таким образом, одной и той же аминокислоте может соответствовать более чем один значащий триплет. Это свойство биологического кода получило название вырожденности, или избыточности.

Вырожденность генетического кода не одинакова для разных амино- кислот. Так, например, лейцин, серин или аргинин кодируются шестью вари- антами триплетов, а аланин, валин, глицин, пролин или треонин — четырьмя вариантами триплетов, различающимися между собой лишь остатком третье- го азотистого основания (см. табл. 6). Более того, стандартный биологиче- ский код двух аминокислот — метионина и триптофана — не вырожден, в генах ядерных ДНК каждая из них шифруется только одним вариантом ко- дона.

Избыточность значащих триплетов — важнейшее свойство биологиче- ского кода, т. к. она повышает устойчивость информационного потока к не- благоприятным воздействиям внешней среды. При определении природы аминокислоты, которая должна быть включена в белок, третий нуклеотид- ный остаток в кодоне не имеет столь большого значения как первые два, т. к. для многих аминокислот его замена не сказывается на смысле кодона.

Три кодона из 64 возможных (УАА, УАГ и УГА) не шифруют ни одну из протеиногенных аминокислот. Они играют роль сигналов, обозначающих конец записи информации о первичной структуре полипептидной цепи, и на- зываются терминирующими (англ. “to terminate” — завершать), а также стоп-кодонами, нонсенс-кодонами или «бессмысленными».

Специфичность. Каждому значащему триплету стандартного генети- ческого кода соответствует только одна определённая аминокислота. В этом смысле нуклеотидно-аминокислотный код строго однозначен.

 

Непрерывность. Запись информации о первичной структуре белковых молекул является линейной и однонаправленной. В ней отсутствуют «знаки препинания», т. е. сигналы, указывающие на конец одного кодона и начало следующего. Триплеты следуют один за другим непрерывно.

Неперекрываемость. Любой нуклеотидный остаток внутри одного ге- на входит в состав только одного триплета и не может входить одновременно в состав двух или трёх триплетов.

Универсальность. Это важнейшее свойство генетического кода за- ключается в том, что смысловое значение триплетов у всех живущих на Зем- ле организмов одинаковое.

Установление универсальности генетического кода дало возможность целенаправленного манипулирования генетическим материалом и послужило основой возникновения генной инженерии (1972 г.) — новой отрасли науки, занимающейся вопросами пересадки генов из одних организмов в другие и получения необычных комбинаций генов разных организмов. Например, с помощью генной инженерии получают для медицинских целей человеческий интерферон. Этот антивирусный белок синтезируется бактериями, в ДНК ко- торых был введён ген интерферона человека.

Однако генетический код универсален не абсолютно. В ДНК митохон- дрий и у некоторых простейших организмов он немного отличается от кано- нического.

 

2.10.   Наследование генетической информации

Одна из особенностей генетической информации состоит в том, что  она может наследоваться, т. е. передаваться от поколения к поколению. Ме- ханизм наследования генетической информации основывается на способно- сти её материальных носителей — молекул нуклеиновых кислот к самокопи- рованию (удвоению). Процесс самокопирования нуклеиновых кислот назы- вают репликацией (лат. “replicatio” — повторение) или редупликацией (лат. “reduplicatio” — удвоение).

 

У всех клеточных организмов материальными носителями генетиче- ской информации являются двухцепочечные молекулы ДНК.

Репликация молекул ДНК предшествует делению клетки. Процесс на- чинается с раскручивания двойной спирали и разрыва водородных связей между полинуклеотидными цепями. В результате двойная спираль ДНК рас- плетается, и цепи расходятся.

В процессе репликации к нуклеотидным остаткам каждой из цепей ро- дительской ДНК, в соответствии с принципом комплементарности азотистых оснований, с помощью водородных связей присоединяются дНТФ — дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Таким образом, каждая цепь родительской молекулы ДНК служит матрицей для биосинтеза дочерней комплементарной цепи, т. е. первичная структура дочерней цепи определяется первичной структурой ро- дительской цепи. Такой принцип синтеза называют матричным.

Образование дочерних полинуклеотидных цепей происходит в резуль- тате многократного повторения реакции переноса остатка дНМФ от дНТФ на свободную 3′-гидроксильную группу остатка дезоксирибозы концевого нук- леотидного остатка синтезируемой цепи. В ходе этой реакции в молекуле дНТФ разрывается макроэргическая связь и выделяется молекула пирофос- форной кислоты (Н4Р2О7, или è~è). Таким образом, дезоксирибонуклео- зидтрифосфаты служат не только строительным материалом для биосинтеза новых цепей ДНК, но также являются источниками энергии, необходимой для процесса репликации.

В результате репликации из одной молекулы ДНК получаются две её точные копии, причём одна из цепей в каждой из образовавшихся молекул ДНК происходит из родительской молекулы, а другая (дочерняя) является вновь синтезированной. Такой механизм биосинтеза ДНК называют полу- консервативным. Схематически процесс репликации ДНК представлен на рисунке 28.

Таким образом, в клетке перед её делением происходит удвоение со- держания ДНК. По окончании репликации клетка делится, при этом каждая

 

дочерняя клетка получает набор хромосом идентичный родительской клетке. Так, генетическая информация, содержавшаяся в одной родительской клетке, передаётся по наследству двум дочерним клеткам.

5′– А – Г – Ц – Т –3′                       5′–А–Г–Ц–Т–3′

MM   MMM   MMM   MM                                   MM MMM MMM  MM дТ  дЦ дГ  дА – n è~è     3′–Т–Ц–Г–А–5′ Т        Т       Т      Т

5′–А–Г–Ц–Т–3′                 Ф   Ф   Ф    Ф

MM MMM MMM MM

3′–Т–Ц–Г–А–5′                 Ф   Ф   Ф   Ф Т      Т   Т    Т

дА  дГ дЦ дТ                             5′–А–Г–Ц–Т–3′

MM   MMM   MMM   MM                                   MM MMM MMM MM

3′– Т – Ц – Г – А –5′   – n è~è     3′–Т–Ц–Г–А–5′

 

В процессе репликации ДНК принимают участие ряд ферментов и дру- гих белков. Раскручивание двойной спирали, которое протекает со скоростью 4500 об/мин, осуществляется ДНК-топоизомеразами. Чтобы избежать вра- щения всей хромосомы при раскручивании спирали ДНК, эти ферменты сна- чала производят в месте её раскручивания кратковременные разрывы одной либо обеих цепей ДНК, а затем, когда после одного или нескольких оборотов цепи раскрутятся, сразу же воссоединяют их обратно. Разрыв водородных связей и расплетание ДНК на две цепи осуществляют ферменты ДНК- хеликазы. Для поддержания цепей ДНК в расплетённом состоянии и предот- вращения их обратного скручивания к расходящимся участкам каждой поли- нуклеотидной цепи присоединяются специальные ДНК-связывающие белки. Так формируется репликативная вилка.

Биосинтез дочерних полинуклеотидных цепей в репликативной вилке, используя принцип комплементарности азотистых оснований, осуществляют ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Скорость наращивания синте- зируемых цепей составляет примерно 50 нуклеотидных остатков в секунду. Если бы репликация молекулы ДНК протекала с помощью одной реплика- тивной вилки, то хромосома человека, состоящая из 150 млн пар нуклеотид-

 

ных остатков, удваивалась бы за 833 с лишним часа. В действительности процесс репликации продолжается 8–10 часов, т. к. биосинтез дочерних ни- тей ДНК начинается сразу в нескольких строго определённых точках хромо- сомы, называемых ориджинами (англ. “origin” — происхождение) реплика- ции. В клетке человека одновременно функционируют до ста тысяч реплика- тивных вилок, при этом удвоение ДНК может происходить сразу в обоих на- правлениях от ориджинов репликации. Участок ДНК между двумя ориджи- нами репликации представляет собой минимальную репликативную единицу, которую называют репликоном.

ДНК-полимеразы осуществляют наращивание каждой дочерней цепи ДНК только в направлении от 5′- к 3′-концу антипараллельно родительской цепи. Таким образом, в репликативной вилке непрерывно синтезироваться может только одна цепь, называемая лидирующей. Направление синтеза ли- дирующей цепи совпадает с направлением движения репликативной вилки. Вторая цепь называется отстающей. Она синтезируется в противоположном направлении, причём короткими цепочками — фрагментами Оказаки, на- званными так по фамилии японских учёных супругов Р. и Т. Оказаки, от- крывших образование этих фрагментов в 1968 г. В одном фрагменте Оказаки может содержаться примерно от 100–200 до 1000–2000 нуклеотидных остат- ков. Ход процесса репликации схематически представлен на рисунке 29.

Ориджин репликации

 

ДНК-полимеразы не способны самостоятельно начать биосинтез до- черних цепей ДНК. Они могут лишь присоединять последующий нуклеотид- ный остаток к предыдущему. Поэтому первый нуклеотидный остаток ДНК- полимераза присоединяет к так называемой затравке, или праймеру, пред- ставляющему собой короткую, состоящую из 10–60 нуклеотидных остатков цепочку РНК, комплементарную определённому участку родительской цепи ДНК. Праймеры синтезируются РНК-полимеразами, или ДНК-праймазами. Именно эти ферменты узнают ориджины репликации.

По завершении синтеза каждого фрагмента Оказаки из него, а также из лидирующей цепи, ДНК-полимераза удаляет РНК-затравки и заполняет обра- зующиеся «бреши» соответствующими дезоксирибонуклеотидными после- довательностями. Затем с помощью фермента ДНК-лигазы фрагменты Ока- заки соединяются друг с другом, и отстающая цепь становится непрерывной.

Когда встречаются две репликативные вилки, процесс репликации на участке ДНК, соответствующем одному репликону, завершается.

 

2.11.   Реализация генетической информации

Генетическая информация реализуется в ходе биосинтеза белков. Этот процесс протекает в цитоплазме клетки в особых органеллах — рибосомах, которые за выполняемую ими функцию называют микрофабриками белков.

Однако материальные носители генетической информации — молеку- лы ДНК сосредоточены у эукариот в клеточном ядре. Поэтому для того что- бы в рибосоме синтезировался белок, в неё от ДНК должна поступить ин- формация о его структуре. Роль посредника, обеспечивающего передачу ге- нетической информации от ядра клетки к рибосомам, т. е. от места её хране- ния к месту реализации, выполняют матричные (информационные) РНК. Процесс считывания генетической информации с молекулы ДНК и записы- вания этой информации в молекулу мРНК (иРНК) называется транскрипци- ей (лат. “transcriptio” — переписывание) генетической информации.

 

Помимо мРНК в рибосому должен поступать материал для синтеза белка — протеиногенные аминокислоты. Их доставляют транспортные РНК. Таким образом, в ходе синтеза белка в рибосоме сливаются два потока — информационный и материальный. Процесс биосинтеза полипептидной цепи в рибосоме называется трансляцией (лат. “translatio” — передача) генети- ческой информации.

Итак, в общем виде механизм реализации генетической информации включает два основных этапа — транскрипцию и трансляцию:

транскрипция                трансляция

ДНК                             мРНК                        Белок

 

Правило реализации генетической информации путём её передачи в направлении от нуклеиновых кислот к белку Ф. Крик в 1958 г. назвал цен- тральной догмой молекулярной биологии (термин «матричная РНК» появил- ся в 1961 г.). Оно является универсальным для всех клеточных организмов.

 

2.11.1.   Транскрипция генетической информации

Транскрипция является первым этапом реализации генетической ин- формации, в ходе которого синтезируется матричная РНК. У эукариот этот процесс протекает в клеточном ядре.

Биосинтез мРНК начинается с расплетания двойной спирали ДНК на небольшом участке и формирования транскрипционной вилки. При этом для процесса транскрипции используется только одна цепь ДНК, называемая матричной, значащей или антисмысловой. Вторую — комплементарную ей цепь ДНК называют кодирующей или смысловой.

В ходе транскрипции к нуклеотидным остаткам расплетённого участка значащей цепи ДНК присоединяются с помощью водородных связей в соот- ветствии с принципом комплементарности азотистых оснований рибонуклео- зидтрифосфаты — АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ. Таким образом, важной особен- ностью биосинтеза мРНК является то, что в ходе этого процесса напротив

 

остатка аденина располагается остаток урацила, а не тимина. Образование мРНК происходит путём переноса остатков рибонуклеотидов от НТФ на сво- бодную 3′-гидроксильную группу остатка рибозы концевого нуклеотидного остатка синтезируемой полинуклеотидной цепи. При этом в молекулах рибо- нуклеозидтрифосфатов происходит разрыв макроэргических связей с выде- лением пирофосфата, что обеспечивает процесс транскрипции необходимой энергией. Наращивание цепи мРНК путём присоединения рибонуклеотидных остатков осуществляют ферменты ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Схема- тически процесс транскрипции представлен на рисунке 30.

 

5′– А – Г – Ц – Т –3′

5′–А–Г–Ц–Т–3′                                                          5′–А–Г–Ц–Т–3′

MM MMM MMM MM                                                                     MM MMM MMM MM

3′–Т–Ц–Г–А–5′                                                          3′–Т–Ц–Г–А–5′

ДНК                             Ф  Ф  Ф   Ф                           ДНК

Т   Т   Т    Т

А   Г    Ц    У                                5′–А–Г–Ц–У–3′

MM   MMM   MMM   MM            – n è~è            мРНК 3′– Т – Ц – Г – А –5′

транскрипция

 

Таким образом, в основе биосинтеза мРНК в процессе транскрипции, так- же как и биосинтеза ДНК в процессе репликации, лежит матричный принцип. Значащая цепь ДНК служит только матрицей для синтеза мРНК и в ходе транс- крипции не изменяется.

Однако в отличие от процесса репликации, в ходе которого удваивается вся молекула ДНК, при синтезе мРНК транскрибируются лишь отдельные участки ДНК-матрицы, включающие один или несколько определённых ге- нов. Непосредственно перед этими участками в молекулах ДНК располага- ются так называемые промоторы (англ. “to promote” — способствовать) — определённые последовательности, состоящие приблизительно из 40–80 или более пар нуклеотидных остатков.  Процесс транскрипции начинается с того,

что фермент РНК-полимераза  узнаёт соответствующий промотор и связыва-

 

ется с ним. Это в свою очередь приводит к локальному расплетанию двойной спирали ДНК на требуемом участке.

РНК-полимераза синтезирует цепь мРНК всегда в направлении от 5′- к 3′-концу. При этом матричная цепь ДНК всегда ориентирована антипарал- лельно синтезируемой РНК. По мере своего движения вдоль цепи ДНК фер- мент расплетает двойную спираль впереди себя и восстанавливает её струк- туру сразу же позади себя. Одновременно с этим уже синтезированные уча- стки мРНК отсоединяются от ДНК-матрицы. Поэтому размер транскрипци- онной вилки составляет всего несколько пар нуклеотидных остатков.

Когда РНК-полимераза достигает специального терминирующего уча- стка в цепи ДНК, процесс транскрипции завершается. Фермент отсоединяет- ся от ДНК-матрицы, и молекула мРНК полностью освобождается. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой еди- ницу транскрипции — транскриптон. У эукариот в состав транскриптона, входит, как правило, один ген, а у прокариот — несколько.

Процесс транскрипции является также путём биосинтеза транспортных и рибосомальных РНК в клетке, т. к. информация о строении этих молекул тоже хранится в структурных генах ДНК. Таким образом, структурные ге- ны представляют собой определённые участки ДНК, в которых содержится целостная информация о первичной структуре одной молекулы белка или одной молекулы РНК. Процесс преобразования генетической информации в белковые молекулы или молекулы РНК получил название экспрессии (лат. “expressio” — выражение) генов. В ДНК имеются также регуляторные ге- ны, которые отличаются тем, что не преобразуются в функционально актив- ные продукты, но регулируют работу структурных генов.

Синтезированные в результате транскрипции цепи РНК представляют собой первичные транскрипты. В большинстве случаев они ещё не явля- ются функционально активными молекулами и приобретают способность выполнять свои биологические функции только после процесса созревания, называемого процессингом (англ. “processing” — обработка, переработка).

 

2.11.2.   Процессинг молекул РНК

Как правило, первичные транскрипты имеют бóльшую длину, чем ци- топлазматические молекулы РНК, и перед тем как принять участие в транс- ляции генетической информации они проходят стадию созревания. Только мРНК прокариот не подвергаются процессингу, т. к. эти молекулы синтези- руются сразу в зрелом виде. Первичные транскрипты, являющиеся предше- ственниками зрелых РНК, называются пре-мРНК, пре-тРНК и пре-рРНК.

Процессинг пре-мРНК. У эукариот процессинг молекул пре-мРНК за- ключается в ряде их ковалентных модификаций на 5′- и 3′-концах и удалении из первичного транскрипта лишних участков.

Модификация 5′-конца пре-мРНК начинается с присоединения к нему остатка ГМФ, который образуется путём отщепления от молекулы ГТФ двух остатков фосфорной кислоты. Остаток ГМФ присоединяется 5′-фосфатной группой к концевой 5′-фосфатной группе 5′-конца пре-мРНК. При этом 5′-ко- нец первичного транскрипта теряет один остаток фосфорной кислоты. По- скольку в немодифицированном виде на 5′-конце пре-мРНК располагается остаток НТФ, то в результате этой реакции возникает необычная 5′,5′-три- фосфатная связь. После этого происходит метилирование остатка гуанина с образованием остатка N7-метилгуанина. Процесс модификации 5′-конца пре- мРНК называют кэпированием (англ. “cap” — шапочка).

Таким образом, кэп представляет собой остаток N7-метилгуанозинтри- фосфата. Он защищает мРНК от возможного гидролиза под воздействием ферментов, а также обеспечивает связывание мРНК с рибосомой.

Модификация пре-мРНК на 3′-конце заключается в присоединении к нему 100–200 остатков АМФ и образовании полиадениловой последователь- ности, получившей название поли-А «хвоста». Процесс модификации 3′-конца пре-мРНК называют полиаденилированием.

Наличие у молекулы мРНК поли-А «хвоста» способствует её выходу из ядра в цитоплазму и препятствует её гидролизу в цитоплазме под воздейст- вием ферментов.

 

Поскольку длина зрелой мРНК эукариот в несколько раз меньше длины соответствующего ей гена, то следовательно в пре-мРНК содержатся как ко- дирующие, так и некодирующие участки. Кодирующие белок участки гена были названы экзонами (англ. “expressing zone” — экспрессируемая, смы- словая зона), а некодирующие — интронами (англ. “intervening zone” — вмешивающаяся в смысловую последовательность зона). В состав зрелой мРНК входят только экзоны, а интроны подлежат удалению из пре-мРНК.

В генах эукариот суммарная длина интронов намного превышает об- щую длину экзонов. В среднем соотношение суммарных размеров интронов и экзонов у эукариот составляет 9:1. У прокариот это соотношение обратное и составляет в среднем 1:9. В генах человека средний размер экзона состав- ляет 145 нуклеотидных остатков, а средний размер интрона — 3365 нуклео- тидных остатков.

Процесс «вырезания» интронов из первичного транскрипта и соедине- ния друг с другом экзонов был открыт в 1977 г. и получил название сплай- синга (англ. “to splice” — сращивать). Он протекает при участии малых ядерных РНК (мяРНК), которые имеют последовательности нуклеотидных остатков, комплементарные последовательностям, расположенным на концах каждого из интронов и экзонов.

Молекулы мяРНК синтезируются путём транскрипции, существуют в виде комплексов с белками и являются катализаторами процесса сплайсинга. РНК, обладающие каталитической активностью, называют рибозимами.

На первом этапе сплайсинга пре-мРНК интрон принимает форму пет- ли, в результате чего концы экзонов сближаются. Затем происходит образо- вание комплементарных пар остатков азотистых оснований между мяРНК и местами стыков обоих концов интрона с экзонами. В результате мяРНК фик- сируют сближение концов экзонов. На втором этапе сплайсинга интрон «вы- резается», а концы экзонов соединяются.

Было также обнаружено, что сплайсинг одного и того же первичного транскрипта может протекать по-разному, и какой-либо участок пре-мРНК в

 

одном случае может оказаться экзоном, а в другом случае — интроном. Сле- довательно, из одной и той же пре-мРНК, в зависимости от варианта сплай- синга, могут образовываться разные зрелые мРНК, различающиеся набором экзонов. Таким образом, в одном структурном гене может содержаться ин- формация о множестве разных белков.

Варианты белков, синтезированных на основе одного и того же гена, называют изоформами. Они структурно схожи и выполняют в организме, как правило, аналогичные функции. Наибольшее из известных число изо- форм белка составляет 38016. Все они закодированы в одном гене плодовой мушки дрозофилы, содержащем 95 альтернативных экзонов.

Механизм процессинга РНК, позволяющий организму синтезировать на основе одного гена множество изоформ белка, получил название альтер- нативного сплайсинга.

В клетках человека альтернативному сплайсингу подвергаются 94 % генов. Остальные 6 % генов сплайсингу не подвергаются вообще, т. к. они не содержат интронов. Следовательно почти все человеческие гены кодируют не по одному, а по нескольку различных белков.

Альтернативный сплайсинг даёт возможность организму, не увеличи- вая числа различных генов и их копий, увеличивать разнообразие белков за счёт роста числа их изоформ. Поэтому, хотя количество генов у высших и у низших организмов примерно одинаковое, разнообразие белков у высших организмов за счёт развития альтернативного сплайсинга значительно боль- шее, чем у низших.

Процесс альтернативного сплайсинга первичных транскриптов боль- шинства генов носит тканеспецифичный характер. В одних тканях организма преобладает синтез одних изоформ белка, в других тканях — синтез других изоформ. Таким образом, в разных тканях организма функционируют раз- личные наборы изоформ белков.

Процессинг пре-тРНК. В ходе процессинга пре-тРНК с её 5′- и 3′-кон- цов удаляются лишние нуклеотидные остатки. При этом на 3′-конце форми-

 

руется акцепторный участок, к которому впоследствии должна будет присое- диняться соответствующая аминокислота. У всех тРНК этот участок одина- ковый; он образован последовательностью, состоящей из трёх нуклеотидных остатков — L–Ц–Ц–А–3′. В одних случаях для формирования акцепторного участка с 3′-конца пре-тРНК удаляются нуклеотидные остатки до тех пор, пока не будет достигнута последовательность L–Ц–Ц–А–3′, в других случа- ях эта последовательность присоединяется к пре-тРНК.

Часто молекулы предшественников тРНК содержат две или более по- следовательностей, соответствующих зрелым тРНК. Такие пре-тРНК в ходе процессинга расщепляются, и из одного предшественника образуется сразу несколько разных тРНК.

У эукариот многие предшественники тРНК содержат интрон, который удаляется. Последующий сплайсинг приводит к формированию в молекуле тРНК антикодоновой петли — специальной области, ответственной за узна- вание транспортной РНК соответствующего участка матричной РНК при биосинтезе белка.

Наконец, в ходе процессинга пре-тРНК ряд остатков азотистых основа- ний в ней различным образом модифицируется. Одни из них метилируются, другие — восстанавливаются, третьи — дезаминируются и т. д. Так в составе тРНК появляются минорные основания. Только после этого формируется структура зрелой тРНК.

Процессинг пре-рРНК. В клетках эукариот в большинстве случаев синтезируются четыре типа зрелых рРНК с молекулярными массами прибли- зительно 1,6·106, 6,0·105, 5,0·104 и 4,1·104 Да. Соответственно их образуют около 5000, 2000, 160 и 120 нуклеотидных остатков.

У прокариот синтезируются три типа зрелых рРНК. Их молекулярные массы составляют примерно 1,1·106, 5,6·105 и 4,1·104 Да, а размеры — соот- ветственно около 3000, 1600 и 120 нуклеотидных остатков.

Однако в основу номенклатуры рРНК (и рибосом) положены значения

их молекулярных масс, выраженные не в дальтонах, а в единицах константы

 

седиментации (лат. “sedimentum” — оседание). Эта величина представляет собой отношение скорости седиментации  (осаждения)  частиц  в  воде  при 20 °С в центробежном поле к центробежному ускорению при их ультрацен- трифугировании. За единицу измерения константы седиментации принят 1 сведберг (сб), равный 10–13 с. Обозначают константу седиментации буквой S.

Таким образом, зрелые рРНК, присутствующие в эукариотических клетках, соответственно имеют обозначения 28S, 18S, 5,8S и 5S, а зрелые рРНК прокариот — 23S, 16S и 5S.

Образование 28S, 18S и 5,8S рРНК у эукариот происходит из одного длинного первичного транскрипта — 45S пре-рРНК, молекулярная масса ко- торого составляет приблизительно 4,6·106 Да, а длина — около 13000 нуклео- тидных остатков. Молекулы 5S рРНК у эукариот синтезируются отдельно и сразу в зрелом виде. Процессинг 45S пре-рРНК протекает в ядрышке эука- риотической клетки.

У прокариот синтез 23S, 16S и 5S рРНК также происходит из одного длинного предшественника — 30S пре-рРНК. Его молекулярная масса со- ставляет примерно 2,1·106 Да, а длина — около 5600 нуклеотидных остатков.

Процессинг 45S и 30S пре-рРНК заключается в их метилировании и расщеплении с образованием сначала промежуточных, а затем зрелых рРНК. У прокариот из 30S пре-рРНК обычно также образуются одна или несколько различных молекул зрелых тРНК.

 

2.11.3.   Биосинтез белков

Синтез полипептидных цепочек — самый сложный из биосинтетиче- ских процессов. Он протекает по заданной программе при помощи много- компонентной белоксинтезирующей системы (табл. 7), согласованно функ- ционирующей в цитоплазме клетки. Биосинтез белков складывается из трёх самостоятельных этапов: активации и рекогниции аминокислот, трансляции генетической информации в белковые молекулы и процессинга полипептид- ных цепей.

 

Таблица 7 Основные компоненты белоксинтезирующей системы и их функции

п/п

Необходимые

компоненты

Функции

1

Протеиногенные    ами-

нокислоты

Являются  строительным  материалом  для

биосинтеза белков

2

Ферменты   аминоацил- тРНК–синтетазы

Каждый   фермент   катализирует  реакцию

специфического связывания определённой аминокислоты с соответствующей тРНК

3

Транспортные РНК

Переносят активированные аминокислоты к рибосоме, где находят для каждой амино- кислоты соответствующее ей место в поли-

пептидной цепочке

4

Рибосома

Органелла клетки, служащая местом синте-

за белка

5

Матричная РНК

Переносит информацию о первичной структуре белка от ДНК к рибосоме, где играет роль матрицы, на которой создаётся

полипептидная цепочка

6

Молекулы АТФ и ГТФ

Служат источниками энергии

7

Белковые факторы

Специфические   белки,   стабилизирующие

белоксинтезирующую систему и обеспечи- вающие её функционирование

8

Ионы Mg2+

Обеспечивают   работу   аминоацил-тРНК–

синтетаз и стабилизируют структуру рибо- сомы

9

Десятки                 вспомогатель- ных ферментов

Обеспечивают структурные модификации

полипептидной цепи и формирование про- странственной структуры белка

 

Активация и рекогниция аминокислот

Биосинтез белка начинается с активации свободных протеиногенных аминокислот. Этот процесс заключается во взаимодействии карбоксильной группы аминокислоты с молекулой АТФ и осуществляется при помощи фер- мента аминоацил-тРНК–синтетазы. В ходе реакции образуется богатое энер- гией соединение — прочно связанный с ферментом аминоациладенилат и высвобождается неорганический пирофосфат:

 

О

Н2Ν–СН–СООН  +   АТФ               Н2Ν–СН–С~О–АМФ     +       è~è

|                                                        |

R                                                      R

Аминокислота                                Аминоациладенилат          Пирофосфат (активированная аминокислота)

Затем активированная по карбоксильной группе аминокислота, остава- ясь связанной с ферментом, взаимодействует с молекулой соответствующей зрелой тРНК. При этом образуются аминоацил-тРНК и АМФ, а фермент вы- свобождается:

 

O

Н2Ν–СН–С~О–АМФ

 

+

 

тРНК

О

Н2Ν–СН–С~О–тРНК +   АМФ

|

 

 

|

R

 

 

R

 

Аминоациладенилат                                 Аминоацил-тРНК

 

Таким образом, обе реакции протекают при участии одного фермента. В клетке работает 20 различных аминоацил-тРНК–синтетаз, каждая из кото- рых соответствует определённой аминокислоте: глутамил-тРНК–синтетаза, валил-тРНК–синтетаза и т. д. Эти ферменты имеют специальные участки связывания, строго специфичные как в отношении определённой аминокис- лоты, так и в отношении соответствующей тРНК, что позволяет аминокисло- там и тРНК практически безошибочно узнавать друг друга. Для своей работы аминоацил-тРНК–синтетазы требуют присутствия ионов Mg2+.

 

Процесс узнавания тРНК «своей» аминокислоты, происходящий при помощи соответствующей аминоацил-тРНК–синтетазы, получил название рекогниции (англ. “recognition” — узнавание) аминокислот.

Итак, каждая из 20 протеиногенных аминокислот активируется своим ферментом и каждая из них в результате рекогниции присоединяется к соот- ветствующей тРНК. По наименованию присоединяющейся аминокислоты транспортным РНК дают соответствующие названия, от которых образуют краткие обозначения, например: валиновая тРНК (тРНКВал), аланиновая тРНК (тРНКАла), сериновая тРНК (тРНКСер) и т. д.

Присоединяются аминокислоты макроэргической сложноэфирной свя- зью к 2′- или 3′-ОН группе остатка рибозы, входящей в состав остатка адено- зинмонофосфата, расположенного на 3′-конце тРНК в последовательности

L–Ц–Ц–А–3′. Поэтому 3′-конец тРНК называют акцепторным. Содержа- щаяся в макроэргической связи аминоацил-тРНК энергия используется в дальнейшем при образовании пептидной связи в процессе трансляции.

Помимо этого, в центральной петле «клеверного листа» молекулы тРНК (см. рис. 19) имеется триплет нуклеотидных остатков, комплементар- ный соответствующему кодону мРНК. Этот триплет называют антикодоном. Он обеспечивает взаимодействие тРНК с мРНК в ходе трансляции генетиче- ской информации.

УУЦ

 

На рисунке 31 схематически изображено строение аминоацил-тРНК на примере фенилаланил-тРНК, содержащей антикодон 3′L–А–А–Г–L5′. По- скольку краткое обозначение транспортных РНК включает указание кодона, комплементарного содержащемуся в тРНК антикодону, данная тРНК имеет обозначение тРНК Фен .

Комплекс активированной аминокислоты с транспортной РНК направ- ляется к рибосоме, где тРНК выполняют функцию посредника при переводе с  четырёхбуквенного  «языка»  нуклеиновых  кислот  на двадцатибуквенный

«язык»  белков.  Поэтому  транспортные  РНК  называют  адаптерными (лат.

“adapto” — приспособляю) молекулами.

 

А А Г

антикодон

 

3′-конец

 

 

 

фен

 

5′-конец

 

 

УУЦ

 

Рис. 31. Схема строения аминоацил-тРНК на примере тРНК Фен

 

 

Трансляция генетической информации

Процесс трансляции генетической информации в белковые молекулы протекает в рибосомах, тысячи и десятки тысяч которых находятся в цито- плазме клетки. Эти субклеточные органеллы построены из белков и молекул рибосомальных РНК. Таким образом, по химической природе рибосомы представляют собой нуклеопротеиды.

Существует два основных типа рибосом: эукариотический и прокарио- тический. Молекулярная масса рибосом эукариот составляет 4,2·106 Да, а ри- босом прокариот — 2,5·106 Да. Константы их седиментации составляют со- ответственно 80S и 70S.

Рибосома состоит из двух субчастиц — большой и малой. У эукариот большая субчастица рибосомы имеет молекулярную массу 2,8·106 Да, а малая субчастица — 1,4·106 Да. Соответственно они характеризуются константами седиментации 60S и 40S. Большая субчастица рибосомы прокариот имеет молекулярную массу 1,5·106 Да и константу седиментации 50S, а малая суб- частица — молекулярную массу 0,85·106 Да и константу седиментации 30S.

Большую субчастицу рибосом эукариот составляют 28S рРНК, 5,8S рРНК, 5S рРНК и 49 белков, а малую субчастицу — 18S рРНК и 33 белка. У прокариот большую субчастицу рибосом образуют 23S рРНК,  5S рРНК  и  34 белка, а малую субчастицу — 16S рРНК и 21 белок.

 

Молекулы рРНК играют роль каркаса, на котором в строго определён- ном порядке крепятся рибосомальные белки. Последние выполняют струк- турную функцию, обеспечивая взаимодействие мРНК и аминоацил-тРНК. Для соединения белков с рибосомальными РНК и поддержания структуры рибосом требуются ионы Mg2+.

Процесс трансляции осуществляется в три этапа: инициации, элонга- ции и терминации.

Инициация трансляции. Синтезированная в ядре клетки зрелая мРНК поступает в цитоплазму и связывается с малой субчастицей рибосомы своим 5′-концом. У прокариот в этой области мРНК расположена специальная по- следовательность нуклеотидных остатков, которая узнаётся антипараллель- ной комплементарной последовательностью нуклеотидных остатков, распо- ложенных в области 3′-конца 16S рРНК малой субчастицы рибосомы. Узна- вание 5′-конца мРНК у эукариот происходит, как правило, по расположенно- му на нём кэпу. Молекула мРНК доставляет в рибосому списанный с ДНК и записанный языком триплетного кода план построения первичной структуры полипептидной цепочки.

Матричная РНК соединяется также со специальной аминоацил-тРНК, инициирующей процесс трансляции. У эукариот эту роль выполняет метио- нил-тРНК, а у прокариот — N-формилметионил-тРНК. Таким образом, счи- тывание мРНК начинается с кодона АУГ, получившего название кодона инициации. В клетках эукариот поиск инициирующего кодона происходит, в основном, путём скольжения малой субчастицы рибосомы вдоль цепи мРНК до тех пор, пока он не будет обнаружен. Скольжение малой субчасти- цы рибосомы по мРНК сопровождается расходованием энергии АТФ.

В рибосоме имеется два участка связывания аминоацил-тРНК: пепти- дильный, или P-участок, и аминоацильный, или A-участок. Инициирующая трансляцию аминоацил-тРНК располагается в P-участке, а все последующие аминоацил-тРНК будут присоединяться к A-участку рибосомы.

 

участки связывания

Р       А                                               Р       А

мРНК  5′                            3′                         5′                            3′   мРНК А У Г кодон                                              А У Г У У Ц

MM MM MMM                                                 MM MM MMM MM MM MMM

40S      У А Ц   анти-                                       У А Ц А А Г      40S

                 кодон                                                              

 

 

 

тРНК Мет

АУГ

 

тРНК

 

Мет АУГ

 

тРНК

 

Фен УУЦ

 

 

 

60S              5′                                                       5′       5′       60S

3′                                                        3′       3′

мет                                                     мет    фен

 

 

80S инициирующий комплекс

 

 

 

 

Р       А

мРНК  5′                                  3′

АУ Г У У Ц

MM MM MMM

40S      А А Г

 

направление дви- жения рибосомы

 

 

 

 

 

тРНК Мет-Фен

УУЦ

 

 

60S             5′

3′

фен

 

мет

 

и т. д.

Рис. 32. Схема процесса трансляции генетической информации

 

Образование инициирующего комплекса (рис. 32) завершается присое- динением к нему большой субчастицы рибосомы и сопровождается гидроли- зом молекулы ГТФ с образованием ГДФ и молекулы фосфорной кислоты.

В инициации трансляции также принимают участие многочисленные белковые факторы. У прокариот её обеспечивают три белковых фактора инициации, а у эукариот — не менее 13.

Элонгация трансляции. После завершения образования инициирую- щего комплекса начинается наращивание полипептидной цепи путём после- довательного присоединения к ней аминокислотных остатков. Каждый цикл элонгации протекает в три стадии.

Сначала к кодону мРНК, находящемуся в А-участке рибосомы, присое- диняется вторая аминоацил-тРНК (см. рис. 32, в данном случае фенилаланил- тРНК). Их взаимодействие основано на принципе комплементарности кодона мРНК и антипараллельно расположенного антикодона тРНК. Таким образом аминокислота с помощью тРНК находит соответствующее ей место в синте- зируемой полипептидной цепочке. Процесс связывания аминоацил-тРНК с мРНК сопровождается гидролизом ГТФ на ГДФ и H3PO4.

Затем происходит перенос остатка метионина с его тРНК, находящейся в P-участке рибосомы, на аминогруппу аминоацил-тРНК, находящейся в А-участке рибосомы, и образование между аминокислотными остатками пеп- тидной связи (см. рис. 32):

   
   

Аминоацил-тРНК1            Аминоацил-тРНК2

O

||                   О

Н2Ν–СН–С–N–СН–С~О–тРНК2 +   тРНК1

|           |    |

R1       H R2

Синтезируемая полипептидная цепь

 

Таким образом, синтез полипептидной цепи начинается с N-конца и идёт по направлению к C-концу. Реакцию образования пептидной связи ка- тализирует рибозим, располагающийся в большой субчастице рибосомы. У эукариот эту функцию выполняет 28S рРНК.

Теперь в А-участке рибосомы располагается дипептидил-тРНК, а в

P-участке — свободная тРНК.

На заключительной стадии цикла элонгации происходит перемещение рибосомы вдоль мРНК в направлении от 5′- к 3′-концу на один кодон. Энер- гию для передвижения рибосомы даёт гидролиз ГТФ до ГДФ и фосфорной кислоты. В результате свободная тРНК отсоединяется от P-участка рибосомы и уходит в окружающую среду, а дипептидил-тРНК, не меняя своего поло- жения относительно мРНК, переносится с А-участка рибосомы на P-участок. При этом в А-участок рибосомы попадает следующий  кодон  мРНК  (см.  рис. 32).

После этого начинается новый цикл элонгации. В освободившийся А-участок рибосомы поступает следующая аминоацил-тРНК с антикодоном, комплементарным находящемуся здесь кодону мРНК. Затем синтезируемая полипептидная цепочка переносится от тРНК, находящейся в P-участке ри- босомы, на аминогруппу аминокислотного остатка, присоединённого к тРНК, расположенной в А-участке рибосомы. За этим снова следует смещение ри- босомы вдоль мРНК ещё на один кодон и т. д.

По мере движения рибосомы от кодона к кодону вдоль мРНК к её 3′-концу аминокислотные остатки один за другим добавляются к растущей полипептидной цепи, которая всё это время остаётся связанной с тРНК, соот- ветствующей последнему включённому аминокислотному остатку. Освобо- дившиеся тРНК отделяются и покидают рибосому.

Циклы элонгации трансляции повторяются столько раз, сколько остат- ков аминокислот следует соединить. При этом кодоны молекулы мРНК, слу- жащей матрицей для биосинтеза белка, «читаются» с фиксированной старто- вой точки последовательно и не перекрываются.

 

Так в рибосоме генетическая информация, записанная в нуклеотидной последовательности мРНК с помощью остатков азотистых оснований, вос- производится в виде последовательности аминокислотных остатков в синте- зируемой полипептидной цепочке. Таким образом, трансляция представляет собой процесс перевода генетической информации с языка нуклеиновых ки- слот, использующего четырёхбуквенный алфавит, на язык белков, алфавит которого состоит из двадцати букв.

Процесс элонгации трансляции и у прокариот, и у эукариот протекает при участии трёх белковых факторов.

Терминация трансляции. Окончание биосинтеза полипептидной цепи происходит в тот момент, когда в А-участок рибосомы попадает один из трёх терминирующих кодонов, расположенных на мРНК, — УАА, УАГ или УГА. В клетке не существует таких тРНК, антикодоны которых были бы компле- ментарны этим кодонам. Терминирующие триплеты располагаются в конце каждой кодирующей последовательности нуклеотидных остатков, содержа- щей целостную информацию о первичной структуре белковой молекулы, и служат сигналами для завершения синтеза полипептидной цепочки, коди- руемой мРНК.

У прокариот имеются три белковых фактора терминации трансляции, а у эукариот — не менее двух. Их действие вызывает гидролитическое отщеп- ление полипептида от конечной тРНК и его освобождение, отделение сво- бодной тРНК от P-участка рибосомы, отсоединение рибосомы от мРНК и диссоциацию самой рибосомы на две субчастицы. В терминации трансляции также принимает участие молекула ГТФ.

Полирибосомы (полисомы). Рибосомы эукариот в процессе биосинте- за белков перемещаются вдоль мРНК в направлении от 5′- к 3′-концу со ско- ростью 1–10 триплетов в секунду. У прокариот скорость движения рибосом выше и составляет 10–20 триплетов в секунду. Следовательно, эукариотиче- ской клетке на синтез белковой молекулы требуется несколько минут, а про-

 

кариотической — менее минуты. Например, у кишечной палочки E. coli этот процесс занимает в среднем около 20 секунд.

Однако биосинтез белка в клетке протекает не на одной рибосоме. Как только первая рибосома удалится от 5′-конца мРНК приблизительно на 100 нуклеотидных остатков, к нему может присоединиться вторая рибосома, на которой начнётся биосинтез ещё одной полинуклеотидной цепи. Когда на та- кое же расстояние от 5′-конца мРНК удалится вторая рибосома, к нему может присоединиться третья рибосома и т. д.

В результате образуется комплекс рибосом, которые одновременно и независимо друг от друга участвуют в синтезе белка на одной и той же мРНК. Этот комплекс называют полирибосомой, или полисомой (рис. 33).

 

 

5′                                                                                                                    3′

 

 

 

Таким образом, информация, заключённая в мРНК, одновременно транслируется многими рибосомами, и в клетке происходит синтез сразу не- скольких одинаковых молекул белка, что значительно увеличивает скорость трансляции. Поскольку одна рибосома занимает на мРНК участок длиной около 80 нуклеотидных остатков, рибосомы располагаются в полисоме до- вольно близко друг к другу.

 

Процессинг полипептидных цепей

Синтезированные в процессе трансляции белки, как правило, ещё не являются зрелыми функционально активными молекулами. Способность вы- полнять свои биологические функции они приобретают лишь после ряда структурных изменений, которые могут происходить в полипептидных це- почках как во время их синтеза на рибосомах, так и сразу после его заверше- ния. Эти химические превращения в белковых молекулах соответственно на- зывают котрансляционными и посттрансляционными модификациями, или процессингом.

Разнообразие химических реакций, в ходе которых осуществляются структурные модификации белков, чрезвычайно велико: их число в клетках достигает 300–400. Процессинг различных полипептидных цепей протекает по-разному.

Структурным модификациям, например, могут подвергаться N-концы белковых молекул. Так, в клетках прокариот от N-конца полипептидных це- пей может отщепляться либо формильная группа, либо N-формилметионин, а в клетках эукариот — метионин, т. е. аминокислоты, с которых начинается биосинтез любого белка. С помощью специальных ферментов могут также удаляться целые N-концевые аминокислотные последовательности, либо да- же внутренний участок полипептидной цепи. Нередко в белках N-концевой аминокислотный остаток ацетилируется. Также структурным модификациям, например амидированию, может подвергаться и С-концевой аминокислот- ный остаток полипептидных цепей.

Многие белки подвергаются гликозилированию, в ходе которого к ним присоединяются различные углеводные компоненты. Часто углеводные це- почки прикрепляются к гидроксильным группам остатков серина или трео- нина. Так в результате этих реакций в клетках образуются гликопротеиды.

Процессинг белковых молекул может также включать ферментативное образование дисульфидных связей, а также реакции фосфорилирования ос- татков гидроксиаминокислот, метилирования остатков лизина или глутами-

 

новой кислоты, карбоксилирования остатков кислых аминокислот и многие другие.

Для полноценного функционирования белковой молекулы необходимо, чтобы она сформировала присущую ей нативную конформацию. Процесс частичного формирования вторичной структуры белка начинается, ещё когда N-конец полипептидной цепи только выходит из рибосомы. По окончании трансляции свёртывание белка продолжается до тех пор, пока он не образует биологически активную конформацию. Нативная пространственная структу- ра белковой молекулы определяется аминокислотной последовательностью и может окончательно сформироваться только после того, как будет завершён процесс её структурной модификации.

 

2.11.4.   Регуляция биосинтеза белков

Скорость биосинтеза белка зависит от функционального состояния ДНК, всех видов РНК и белоксинтезирующей системы в целом. Поэтому ме- ханизмы регуляции образования белка реализуются как в ядре, так и в цито- плазме клетки, т. е. как в процессе транскрипции, так и в ходе трансляции, а также на посттрансляционной стадии.

Время жизни синтезированных клеткой белков различно и составляет от нескольких минут и часов до нескольких недель, месяцев и даже лет. Ско- рость деградации белков регулируется протеолитическими ферментами.

 

2.11.5.   Ингибиторы биосинтеза белков

Существует множество веществ, которые при попадании в клетку вы- зывают ингибирование процессов биосинтеза молекул ДНК, РНК или белков. Одни из них используют в медицине для лечения от инфекционных заболе- ваний или в качестве противоопухолевых препаратов, а другие являются ток- сичными.

Основными лекарственными веществами, эффективно влияющими на биосинтез белков, являются антибиотики. Некоторые из них взаимодейст-

 

вуют с ДНК таким образом, что изменяют её структуру. Это вызывает подав- ление процессов репликации и транскрипции. Такие вещества нашли приме- нение как противоопухолевые препараты.

Другие антибиотики, вызывающие ингибирование процессов биосин- теза белков, используют в качестве антибактериальных препаратов. К этой группе веществ принадлежат тетрациклины, соединяющиеся с 30S субчасти- цей рибосомы и ингибирующие присоединение к ней аминоацил-тРНК, стрептомицин, также взаимодействующий с 30S субчастицей рибосомы и на- рушающий процесс считывания информации с мРНК, левомицетин, связы- вающийся с 50S субчастицей рибосомы и ингибирующий образование пеп- тидной связи, пенициллины, ингибирующие фермент, обеспечивающий про- текание конечной стадии биосинтеза белков клеточной стенки бактерий, и многие другие.

Отличительной особенностью антибактериальных препаратов является высокая избирательность их действия и сравнительно малая токсичность для человека, что во многом обусловлено различиями в строении рибосом эука- риотических и прокариотических клеток.

Ингибиторами биосинтеза белков в эукариотических клетках являются также вирусы и токсины, которые, попав в организм человека, могут стать причиной его гибели.

После заражения, например, вирусом оспы, гриппа, гепатита или по- лиомиелита в клетках начинается биосинтез вирусных ДНК, РНК и белков с использованием ферментов, веществ и источников энергии клетки хозяина. При этом синтез нуклеиновых кислот и белков, свойственных организму хо- зяина, в инфицированных клетках прекращается. В результате заражённая клетка погибает.

В ответ на поражение вирусами клетки организма вырабатывают ин- терфероны — белки, способные вызывать синтез веществ, разрушающих мРНК вирусов. Это приводит к прекращению биосинтеза в клетках вирусных белков. Таким образом, интерфероны препятствуют размножению вирусов.

 

В настоящее время интерфероны получают промышленным путём ме- тодами генной инженерии. Их широко применяют при лечении от всех видов респираторных вирусных инфекций, ветряной оспы, герпеса, гепатита и др.

Токсины — это вещества природного происхождения, главным обра- зом белки и пептиды, которые при попадании в организм вызывают в нём выработку антител.

Чрезвычайно токсичным, например, является рицин — белок расти- тельного происхождения, содержащийся в семенах клещевины. Этот токсин ингибирует биосинтез белков в клетках эукариот, воздействуя на 28S рРНК 60S субчастицы рибосомы. Рицин присутствует в вырабатываемом из семян клещевины касторовом масле, которое иногда используют в качестве слаби- тельного средства. Однако длительное применение этого лекарства может привести к диарее, расстройству работы кишечника и даже смерти больного.

Гибель человека может наступить при отравлении α-аманитином — высокотоксичным пептидом, содержащимся в бледной поганке. Это вещест- во ингибирует ферменты ДНК-зависимые РНК-полимеразы, участвующие в процессе транскрипции, и вызывает нарушение работы печени и почек.

При инфицировании дифтерийной палочкой у человека возникает ост- рое заболевание, характеризующееся токсическим поражением организма, — дифтерия. Эта бактерия вырабатывает дифтерийный токсин — белок, угне- тающий активность ферментов, участвующих в процессе трансляции. В ре- зультате в инфицированных клетках прекращается биосинтез белков, и они погибают.

 

2.12.   Мутации

Выполнение молекулами ДНК и РНК своих биологических функций происходит в клетках таким образом, что генетическая информация хранит- ся, передаётся от поколения к поколению и реализуется, обеспечивая консер- ватизм свойств живых организмов, т. е. сохранение их наследственных при- знаков.

 

Однако в самом механизме наследственности заложена и возможность изменчивости организмов. И весьма существенную роль в этом играют про- цессы мутаций (лат. “mutatio” — изменение). Генная мутация — это любое изменение в последовательности нуклеотидных остатков в гене. Зная меха- низм процесса биосинтеза белка, можно легко представить, что почти любое изменение в нуклеотидной последовательности ДНК должно приводить, в конечном счёте, к изменению в аминокислотной последовательности белка.

Как правило, с такими изменениями связано появление различных на- следственных патологий, сопровождающихся прекращением биосинтеза бел- ка, кодируемого повреждённым геном, либо биосинтезом изменённого белка с нарушением той функции, которую данный белок выполняет. Примером тому может служить возникновение болезни, называемой серповидноклеточ- ной анемией. Это заболевание является результатом замены только одного нуклеотидного остатка в гене, отвечающем за биосинтез белка крови — ге- моглобина. Такая замена влечёт за собой соответствующее изменение в ами- нокислотной последовательности: в β-цепи гемоглобина шестой аминокис- лотный остаток с N-конца — остаток глутаминовой кислоты заменяется ос- татком валина. Следствием этого является изменение формы красных кровя- ных телец и нарушение функции переноса кислорода.

Болезни, подобные серповидноклеточной анемии, получили название молекулярных болезней, т. к. нарушение функций в этих случаях вызывает- ся повреждением или нарушением биосинтеза молекул соответствующих белков.

Теоретически можно себе представить, что некоторые мутации могут оказать на организм и положительное воздействие. Однако на практике такие мутации возникают чрезвычайно редко, хотя именно они лежат в основе эво- люционного процесса.

Мутационные изменения, возникающие в структуре ДНК и сохраняю- щиеся при репликации, могут быть спонтанными и индуцированными. Спонтанные мутации появляются без участия каких-либо повреждающих

 

факторов, например, в результате ошибок репликации или дезаминирования остатков азотистых оснований. Частота таких мутаций невелика и составляет всего 10–5–10–8 случаев на клетку. В основном имеют место индуцированные мутации, обусловленные воздействием на генетический аппарат клетки внешних факторов: радиации, вирусов, чужеродных химических соединений. Количество мутагенных факторов в нашей жизни постоянно растёт. И одной из причин этому является нарушение экологии: загрязнение воды и воздуха различными химическими отходами промышленных предприятий, химическими средствами защиты растений и т. д. Росту числа мутаций спо- собствуют и непродуманные изменения технологий, в частности технологий пищевых производств. Так, например, выраженной мутагенной активностью обладает ряд пищевых добавок: нитратов, пищевых красителей, стабилизато- ров, вкусовых добавок. К мутагенным факторам относится также увеличение общего фона радиации и использование лекарственных препаратов, воздей-

ствующих на генетический аппарат клетки.

Поэтому задача специалиста, в какой бы области он ни работал, так ор- ганизовывать и проводить производственный процесс, чтобы в ходе него не возникала ещё большая опасность для жизни и здоровья человека в виде до- полнительных мутагенных факторов.

 

2.12.1. Генные мутации

Различают три основных типа генных мутаций: замены, делеции (лат. “deletio” — уничтожение) и инсерции (лат. “inserto” — вставлять) нуклео- тидных остатков.

Мутации по типу замены. Такие мутации представляют собой замену в молекуле ДНК одного нуклеотидного остатка на другой, в результате чего происходит изменение нуклеотидного состава в одном из триплетов гена.

Однако из-за вырожденности генетического кода может получиться так, что изменённый триплет будет обеспечивать включение в белок той же аминокислоты, что и исходный. В этом случае аминокислотная последова-

 

тельность в синтезируемой полипептидной цепи останется прежней. Поэтому такие мутации получили название молчащих, например:

 

Триплет в ДНК

Кодон в мРНК

исходный

3′–АГА–5′

5′–УЦУ–3′

изменённый 3′–АГЦ–5′

5′–УЦГ–3′

Аминокислота

 

–Сер–

–Сер–

 

Если же замена одного нуклеотидного остатка в триплете влечёт за со- бой замену включаемой в синтезируемый белок аминокислоты, то такое му- тационное изменение называют миссенс-мутацией (англ. “mis-” — непра- вильный + “sense” — смысл):

 

Триплет в ДНК

Кодон в мРНК

исходный

3′–ГАА–5′

5′–ЦУУ–3′

изменённый 3′–ГТА–5′

5′–ЦАУ–3′

Аминокислота

 

–Лей–

–Гис–

 

Возможны различные последствия миссенс-мутаций.

В том случае если заменённая в результате мутации аминокислота рас- полагается в области полипептидной цепи, не имеющей функционального значения, то белковая молекула сохраняет свою биологическую активность.

Возможно также, что замена аминокислоты в белке приведёт к тому, что он, сохранив в целом способность выполнять свою функцию, будет рабо- тать менее эффективно. Именно это наблюдается в случае болезни серповид- ноклеточной анемии.

Замена аминокислоты может произойти и в важной для проявления биологической активности белковой молекулы области, например, в актив- ном центре фермента. Тогда образуется функционально неактивный белок, и такая мутация может стать летальной.

Однако наиболее опасными являются такие замены одного нуклеотид- ного остатка в молекуле ДНК, которые приводят к возникновению на месте кодона, соответствующего аминокислоте, одного из терминирующих трипле-

 

тов — УАА, УАГ или УГА. Такие мутационные изменения называют нон- сенс-мутациями (англ. “nonsense” — бессмысленный), например:

 

Триплет в ДНК

Кодон в мРНК

исходный

3′–ЦТТ–5′

5′–ГАА–3′

изменённый 3′–АТТ–5′

5′–УАА–3′

Аминокислота

 

–Глу–

 

В случае нонсенс-мутации при попадании терминирующего триплета в рибосому её работа будет остановлена, биосинтез полипептидной цепи пре- рвётся и образуется дефектный, функционально неактивный белок.

В редчайших случаях мутация по типу замены может привести к обра- зованию белка, функция которого видоизменится в лучшую сторону. Орга- низмы с такими мутационными изменениями получают преимущества в борьбе за существование. Закрепляясь в потомстве, эти изменения определя- ют направление эволюционного процесса.

Мутации по типу делеции или инсерции. Эти мутации очень много- численны, и они являются наиболее опасными для клетки.

Мутация в цепи ДНК, представляющая собой делецию (выпадение) или инсерцию (вставку) одного нуклеотидного остатка либо целого нуклеотидно- го звена, в котором число нуклеотидных остатков не кратно трём, приводит к сдвигу рамки считывания всех триплетов в ДНК, следующих за местом му- тации, например:

Нормальный белок    N–Вал–Глу–Цис–Тре–C Нормальная мРНК   5′-ГУУ-ГАА-УГУ-АЦУ-3′ Нормальная ДНК     3′-ЦАА-ЦТТ-АЦА-ТГА-5′

делеция Ц                                            инсерция Т

 

Мутантные ДНК

 

Мутантные мРНК

3′-ЦАА-ТТА-ЦАТ-ГА-5′

 

5′-ГУУ-ААУ-ГУА-ЦУ-3′

3′-ЦАА-ЦТТ-АЦТ-АТГ-А-5′

 

5′-ГУУ-ГАА-УГА-УАЦ-У-3′

Мутантные белки

N–Вал–Асн–Вал–C

N–Вал–Глу–C

 

Начиная с места мутации по типу делеции или инсерции, происходит сбой в правильном прочтении генетической информации, и синтезируемая полипептидная цепочка за местом мутационного изменения будет содержать случайную аминокислотную последовательность.

Зачастую мутации этого типа приводят к появлению внутри гена тер- минирующего кодона, что вызывает обрыв биосинтеза белка на рибосоме и образование укороченной полипептидной цепи, не обладающей биологиче- ской активностью.

Таким образом, сдвиг рамки считывания генетической информации меняет всю программу биосинтеза полипептидной цепи за местом мутации, в результате чего образуются функционально неактивные белки, которые бы- стро деградируют в клетках.

 

2.13.   Репарация ДНК

В клетках существуют механизмы, позволяющие исправлять возни- кающие в ДНК повреждения. Процесс устранения ошибок в структуре ДНК называют репарацией (лат. “reparatio” — восстановление).

Как правило, нарушение происходит только в одной из нитей ДНК, в то время как во второй нити нуклеотидная последовательность напротив по- вреждения сохраняется в неизменном виде. Таким образом, существование механизмов репарации основано на том, что молекула ДНК состоит из двух комплементарных друг другу полинуклеотидных цепей. И если произойдёт повреждение какого-либо участка одной полинуклеотидной цепи, то изме- нённую генетическую информацию можно будет восстановить с помощью второй цепи, поскольку обе они являются копиями друг друга.

Наиболее полно изучены механизмы репарации ДНК, имеющей повре- ждения, полученные вследствие воздействия ультрафиолетового облучения. УФ-лучи вызывают в молекуле ДНК фотохимическую реакцию, при которой два соседних остатка пиримидиновых азотистых оснований взаимодействуют друг с другом. Например, могут прореагировать между собой два соседних

 

остатка тимина с образованием тиминового димера, который при репликации ДНК будет препятствовать работе фермента ДНК-полимеразы на участке по- линуклеотидной цепи, находящейся за димером.

 

3′–Г–А–Г–Ц–Т–Ц–А–Г–Ц–Г–А–А–Ц–А–Т–Г–Г–А–Ц–Т–5′

MMM MM MMM MMM MM MMM MM MMMMMMMMM MM MM MMM MM MM MMM MMM MM MMM MM

5′–Ц–Т–Ц–Г–А–Г–Т–Ц–Г–Ц–Т–Т–Г–Т–А–Ц–Ц–Т–Г–А–3′

воздействие УФ-лучей 3′–Г–А–Г–Ц–Т–Ц–А–Г–Ц–Г–А–А–Ц–А–Т–Г–Г–А–Ц–Т–5′

MMM MM MMM                                                        MMM MM MMM MM

5′–Ц–Т–Ц                                                        Ц–Т–Г–А–3′

Г–А–Г–Т–Ц–Г–Ц–Т–Т–Г–Т–А–Ц

тиминовый димер

удаление повреждённого участка 3′–Г–А–Г–Ц–Т–Ц–А–Г–Ц–Г–А–А–Ц–А–Т–Г–Г–А–Ц–Т–5′

MMM MM MMM                                                        MMM MM MMM MM

5′–Ц–Т–Ц                                                        Ц–Т–Г–А–3′

заполнение бреши 3′–Г–А–Г–Ц–Т–Ц–А–Г–Ц–Г–А–А–Ц–А–Т–Г–Г–А–Ц–Т–5′

MMM MM MMM MMM MM MMM MM MMM MMM MMM MM MM MMM MM MM MMM MMM MM MMM MM

5′–Ц–Т–Ц–Г–А–Г–Т–Ц–Г–Ц–Т–Т–Г–Т–А–Ц Ц–Т–Г–А–3′

соединение цепи 3′–Г–А–Г–Ц–Т–Ц–А–Г–Ц–Г–А–А–Ц–А–Т–Г–Г–А–Ц–Т–5′

MMM MM MMM MMM MM MMM MM MMMMMMMMM MM MM MMM MM MM MMM MMM MM MMM MM

5′–Ц–Т–Ц–Г–А–Г–Т–Ц–Г–Ц–Т–Т–Г–Т–А–ЦЦ–Т–Г–А–3′

 

Рис. 34. Репарация ДНК, повреждённой УФ-лучами

 

Процесс репарации повреждённой ДНК происходит в клетке в не- сколько этапов при участии ряда ферментов (рис. 34). Сначала ферментная система, получившая название эксцинуклеазы (лат. “excisio” — вырезание), выявляет тиминовый димер и разрывает полинуклеотидную цепь по обе сто-

 

роны от повреждения на некотором расстоянии от него, после чего одноце- почечный фрагмент ДНК, содержащий измененные нуклеотидные остатки, удаляется. После вырезания повреждённого олигонуклеотида к однонитево- му участку неповреждённой цепи ДНК присоединяются специальные белки, защищающие его от возможного разрушающего воздействия ферментов нук- леаз. Затем фермент ДНК-полимераза синтезирует в направлении от 5′- к 3′-концу олигонуклеотидный фрагмент ДНК, используя комплементарную цепь в качестве матрицы, и тем самым заполняет образовавшуюся брешь. На заключительном этапе репарации с помощью фермента ДНК-лигазы 3′-конец вновь синтезированного фрагмента соединяется с 5′-концом репарируемой цепи ДНК, и таким образом восстанавливается её целостность. После того как повреждения в молекуле ДНК полностью устраняются, восстанавливает- ся её нативная двойная спираль.

Пиримидиновые димеры образуются в клетках кожи людей при попа- дании на неё открытых солнечных лучей. Однако возникающие повреждения в молекулах ДНК быстро устраняются с помощью механизма репарации. Ес- ли же этот механизм генетически нарушен, то у человека развивается тяжё- лое заболевание кожи — пигментная ксеродерма, при котором наблюдается повышенная чувствительность кожи к УФ-облучению. Со временем в очагах поражения развивается рак кожи. Поэтому таким больным следует избегать избыточного воздействия солнечных лучей и применять светозащитные кре- мы. Данное заболевание встречается крайне редко и является наследствен- ным.

 

2.14.   Практическое использование ДНК-технологий

Достижения молекулярной биологии в области клонирования генов по- зволили разработать способы получения ценных эукариотических белков пу- тём их синтеза микробными клетками. В настоящее время с использованием этой технологии получают такие белки, как инсулин человека, применяемый для лечения от сахарного диабета, гормон роста человека, применяемый для

 

преодоления задержки роста у детей, обусловленной недостаточностью этого гормона, фактор свёртывания крови, предназначенный для лечения больных гемофилией, у которых он отсутствует, а также интерфероны, миоглобин, вакцины против некоторых вирусов и многие другие.

Методами белковой инженерии путём направленного введения мута- ций в структурный ген производят замены аминокислот в синтезируемых белках с целью повышения их биологической активности и улучшения дру- гих свойств.

ДНК-технологии успешно применяются для диагностики наследствен- ных заболеваний, а также в судебно-медицинской практике, например для установления отцовства или принадлежности биологического материала, об- наруженного на месте преступления, тому или иному лицу.

В последние годы бурно развивается генотерапия — новое медицин- ское направление, ориентированное на исправление генных дефектов и изле- чение от наследственных заболеваний путём внесения в клетки человека ис- правленных, лишённых мутаций генов.

С помощью методов генной инженерии путём искусственного введения в геном одного организма гена другого организма были созданы организмы с новыми свойствами, получившие название трансгенных. Создание таких ор- ганизмов используют в сельском хозяйстве для получения новых сортов рас- тений и пород животных. Так, удалось получить растения с повышенной продуктивностью, устойчивые к вредителям, болезням, гербицидам. С по- мощью трансгенных животных получают биологически активные вещества, используемые для нужд медицины и фармакологии.

Однако в настоящее время сложилась ситуация, когда бурное развитие молекулярной биологии и активное внедрение в практику методов генной инженерии сочетается с неумением пользоваться накопленными человечест- вом знаниями в этой области и недостаточным осознанием последствий сво- их действий. На сегодняшний день нельзя с уверенностью сказать, является ли использование в пищу продуктов, полученных из генетически модифици-

 

рованных организмов, безвредным, или же оно приносит вред. Также никто точно не знает, какое влияние на природу может оказать возделывание на полях трансгенных растений, к каким последствиям может привести приме- нение генотерапии и т. д. Существуют и морально-этические проблемы, свя- занные с вопросом клонирования человека. Поэтому в большинстве стран мира деятельность в области генной инженерии находится под строгим госу- дарственным контролем.

 

Вопросы для самоконтроля знаний

  1. Назовите продукты частичного и полного гидролиза нуклеиновых кислот.
  2. Какие типы азотистых оснований встречаются в нуклеиновых кисло-

тах?

  1. Напишите формулы пиримидина и пурина, пронумеруйте атомы в

кольцах.

  1. Назовите главные пиримидиновые и пуриновые основания, входя- щие в состав нуклеиновых кислот.
  2. Какие сахара встречаются в нуклеиновых кислотах? Напишите их формулы и пронумеруйте углеродные атомы.
  3. Что такое комплементарность азотистых оснований?
  4. Как образуются нуклеозиды? Напишите общую формулу нуклеози-

 

дов.

 

 

 

  1. Назовите пуриновые и пиримидиновые нуклеозиды.
  2. Как построены нуклеотиды?
  3. Напишите формулы нуклеотидов АМФ, ЦМФ, дТМФ и дайте их

 

полное название.

  1. Какова биологическая роль нуклеотидов?
  2. Какие связи называют высокоэнергетическими и как они обознача-

ются?

 

  1. Напишите общую формулу НДФ и НТФ. Дайте полное название этих соединений.
  2. Приведите примеры НДФ и НТФ.
  3. Напишите реакцию образования АДФ и АТФ.
  4. Напишите формулу АТФ.
  5. Сколько высокоэнергетических связей содержит АДФ и АТФ?
  6. Какую роль в организме играет АТФ?
  7. В чём биологическое значение процесса

АТФ + Н2О          АДФ + Н3РО4?

  1. Какие процессы в клетке обеспечивают накопление энергии в АТФ?
  2. Для осуществления каких процессов клетка расходует энергию АТФ?
  3. Напишите реакцию образования вторичного источника энергии

УТФ.

  1. Какие типы нуклеиновых кислот Вы знаете и каковы их химические

особенности?

  1. Расскажите о локализации в клетке ДНК и РНК.
  2. Какова молекулярная масса ДНК и РНК?
  3. Назовите виды РНК и кратко охарактеризуйте их функции.
  4. Из каких нуклеотидов построены молекулы РНК?
  5. Напишите фрагмент полинуклеотидной цепи РНК.
  6. Что представляет собой первичная структура РНК?
  7. Из каких нуклеотидов образуется молекула ДНК?
  8. Напишите фрагмент молекулы ДНК.
  9. По какому принципу формируется двойная спираль ДНК?
  10. На чём основан метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот?
  11. Расскажите об опытах, которые показали, что нуклеиновые кислоты контролируют синтез белков в клетке.
  12. Какие функции выполняют нуклеиновые кислоты?

 

  1. В каких молекулах хранится генетическая информация?
  2. В чём биологическая роль генетического кода?
  3. Что такое триплет и каково его смысловое значение?
  4. Что такое ген?
  5. Каковы важнейшие особенности генетического кода?
  6. В чём биологическое значение двуспиральной структуры ДНК?
  7. Какой механизм обеспечивает наследование генетической инфор- мации? Расскажите о нём.
  8. В каком процессе реализуется информация, хранящаяся в ДНК?
  9. Что Вы знаете о рибосомах?
  10. Какие соединения выполняют функцию посредника в передаче ин- формации от ядра к рибосоме?
  11. Какие этапы включает в себя механизм реализации генетической информации? Напишите схему потока информации в клетке.
  12. Расскажите о процессе транскрипции.
  13. Что происходит с генетической информацией в процессе синтеза мРНК?
  14. Чем определяется длина синтезируемой полинуклеотидной цепочки мРНК?
  15. Напишите реакцию активирования аминокислоты. Какой фермент катализирует этот процесс?
  16. Какова функция тРНК?
  17. В чём проявляется специфичность активирующих аминокислоты ферментов и тРНК?
  18. Что такое антикодон и какова его биологическая роль?
  19. Расскажите о процессе трансляции.
  20. Назовите процессы, в которых реализуется принцип комплементар- ности.
  21. Назовите функции мРНК и рРНК.
  22. Что такое мутация?

 

  1. Что Вы знаете о молекулярных болезнях?
  2. В чём значение механизма репарации ДНК?
  3. Что Вам известно о практическом использовании ДНК-технологий?

 

III.    ФЕРМЕНТЫ

Ферменты (энзимы) — это биологические катализаторы белковой природы.

Ферменты образуются и функционируют в любой живой клетке, обес- печивая высокую скорость протекания биохимических процессов. В одной клетке может содержаться до 1000 различных ферментов, катализирующих всевозможные реакции расщепления молекул питательных и иных веществ, запасания и преобразования химической энергии, построения из простых со- единений разнообразных макромолекул, входящих в состав клетки.

Каждая клетка обладает собственным генетически заданным набором ферментов, распределённых в её содержимом не хаотично, а строго упорядо- ченно. Ферменты, катализирующие в клетках различные метаболические процессы, локализуются в соответствующих внутриклеточных структурах, организуясь в ферментные системы. Это позволяет строго согласовывать по- следовательность многих сотен химических превращений и определять на- правление обмена веществ на уровне клеток, тканей, органов и организма в целом.

В каждой ферментной системе имеется хотя бы один фермент, обла- дающий способностью изменять свою каталитическую активность при изме- нении условий существования живого организма. Такие ферменты получили название регуляторных. Они регулируют скорость различных метаболиче- ских процессов, обеспечивая соответствие обмена веществ изменяющимся условиям.

Таким образом, ферменты представляют собой движущую силу обме- на веществ организма. Великий российский физиолог И. П. Павлов так писал о ферментах: «Все химические процессы направляются в теле именно этими веществами, они есть возбудители всех химических превращений. Все эти вещества играют огромную роль, они обуславливают собою те процессы, благодаря которым проявляется жизнь, они и есть в полном смысле возбуди- тели жизни».

 

Вот почему в случае недостаточной активности (вследствие нарушения первичной структуры молекулы фермента) или полного отсутствия одного или нескольких ферментов в организме возникают молекулярные болезни

— генетически обусловленные наследственные заболевания. Избыточная ак- тивность того или иного фермента также негативно отражается на состоянии организма.

Очевидно, что изучение ферментов имеет огромное научное и практи- ческое значение. Использование тех или иных ферментативных процессов является основой таких отраслей промышленности, как хлебопечение, пиво- варение, виноделие, сыроделие, производство чая, табака, спирта, аминокис- лот, витаминов, антибиотиков и др.

 

3.1.   Из истории развития учения о ферментах

Уже в глубокой древности люди в своей практической деятельности, например при изготовлении хлеба, пива, вина, уксуса, сыра и т. д., сталкива- лись с различными ферментативными процессами. Однако на протяжении тысячелетий использование этих древнейших пищевых технологий было ос- новано лишь на эмпирических знаниях.

В начале XVII в. голландский естествоиспытатель Я. Б. ван Гельмонт обнаружил, что при брожении образуется какой-то газ, отличающийся от воздуха. Неизвестный агент, вызывающий образование пузырьков газа, он назвал ферментом (лат. “fermentum” — закваска, бродильное начало от “fer- vere” — вскипать или “ferveo” — пениться, возбуждать).

Слово fermentum ещё в I в. н. э. употребляли римляне: так они называли процесс взрыхления почвы, а римский философ и государственный деятель Л. А. Сенека использовал его также при описании процесса получения мёда. Для обозначения процессов брожения, которые в те времена считали мисти- ческими, применяли слово «ферментация». Оба понятия существовали неза- висимо друг от друга.

 

Средневековые алхимики ферментами называли неведомые силы, ко- торые запускают химические реакции, не принимая в них непосредственного участия. Процесс брожения они объясняли действием некоего духа — фер- мента.

Я. Б. ван Гельмонт охарактеризовал фермент как агент, вызывающий химические процессы и управляющий ими. Он предположил, что перевари- вание пищи в желудочно-кишечном тракте так же, как и процесс брожения, происходит при участии ферментов.

В 1783 г. итальянский биолог Л. Спалланцани провёл опыт по искусст- венному пищеварению и обнаружил, что желудочный сок хищных птиц ока- зывает переваривающее воздействие на мясо и вне желудка под влиянием ка- кого-то агента, содержащегося в желудочном соке.

В 1814 г. российский химик К. С. Кирхгоф установил, что под воздей- ствием водных вытяжек из проросшего зерна (солода) крахмал превращается в сахар. Описание действующего начала этих вытяжек было первым научным описанием фермента, названного впоследствии амилазой, а сами вытяжки — первым ферментным препаратом, полученным в виде раствора. Поэтому дату открытия К. С. Кирхгофа считают моментом возникновения современной науки о ферментах — энзимологии (ферментологии).

В 1833 г. французские химики А. Пайен и Ж. Ф. Персо осадили фер- мент, открытый К. С. Кирхгофом, путём обработки водных вытяжек из соло- да спиртом. Таким образом было показано, что ферменты могут быть выде- лены не только в виде растворов, но и в виде сухих препаратов.

В 1836 г. немецкому физиологу Т. Шванну удалось выделить из желу- дочного сока ферментный препарат  пепсина,  а  французскому  физиологу  Л. Корвизару в 1856 г. — ферментный препарат трипсина из сока поджелу- дочной железы. Пепсин и трипсин — это ферменты, расщепляющие белки.

В 1846 г. французский биохимик О. П. Дюбрёнфо открыл в дрожжах растворимый фермент инвертазу, расщепляющий сахарозу на составные час- ти — глюкозу и фруктозу. Таким образом, было выяснено, что сахароза мо-

 

жет расщепляться не только внутри живых дрожжевых клеток, но и вне их под воздействием извлекаемого из дрожжей вещества.

Ещё в 1835 г. шведский химик Й. Я. Берцелиус, сравнив процессы брожения, воздействия солода на крахмал, переваривающего воздействия желудочного сока с процессами расщепления крахмала кислотами, разложе- ния пероксида водорода платиной и т. п., отметил, что все они вызываются агентами, которые как будто не участвуют в реакциях, а воздействуют на них лишь своим присутствием. Он назвал это явление катализом (греч. “χατάλυσις” — разрушение), а агенты, его вызывающие, — катализаторами.

Однако природа каталитических процессов ещё долгое время остава- лась неясной. Только после 1894 г., благодаря работам немецкого физика и химика В. Оствальда, понятие «катализ» приобрело современный смысл.

К середине XIX в. накопился значительный фактический материал о распространении ферментов в природе. Новым этапом в развитии энзимоло- гии явились работы, главной задачей которых было получение ферментов в высокоочищенном состоянии и выяснение их химической природы.

В 1862 г. российский биохимик А. Я. Данилевский, используя разрабо- танный им метод адсорбции, разделил пищеварительные ферменты трипсин и амилазу поджелудочной железы. В последующем этот метод стал широко применяться для разделения различных ферментов.

В 1871 г. знаменитый французский химик и микробиолог Л. Пастёр, исследовав природу процессов брожения, пришёл к заключению, что фер- менты, его вызывающие, неотделимы от живых клеток микроорганизмов. Поэтому ферменты стали отождествлять с самими микроорганизмами, вы- зывающими процессы брожения (дрожжами, молочнокислыми бактериями).

В то же время растворимые ферменты (амилаза, инвертаза, пепсин, трипсин и др.) легко извлекались из клеток экстрагированием или могли быть получены в виде бесклеточных ферментных препаратов. В 1878 г. не- мецкий физиолог В. Кюне предложил называть такие ферменты энзимами

 

(греч. “εν ζύμη” — в дрожжах), т. к. по своему действию они были похожи на вещества-катализаторы, содержащиеся в дрожжах.

Однако немецкий химик Ю. Либих придерживался иной точки зрения и выступал против деления биологических катализаторов на ферменты и эн- зимы. Ещё в 1844 г. он высказал мысль о том, что брожение — это чисто хи- мический процесс. Ю. Либих утверждал, что процессы брожения катализи- руют не живые клетки микроорганизмов, а содержащиеся в них химические вещества.

Наконец, в 1897 г. другому немецкому химику Э. Бухнеру удалось экс- периментально доказать, что бесклеточный дрожжевой сок так же способен осуществлять процесс брожения, как и неразрушенные дрожжевые клетки. Тем самым была доказана правота Ю. Либиха и его сторонников.

После этих исследований делить биологические катализаторы на фер- менты и энзимы больше не имело смысла, и оба термина стали употреблять- ся как синонимы. В настоящее время в странах Западной Европы и Америки чаще пользуются термином «энзим», а в России и Германии — термином

«фермент».

Следующим этапом в развитии энзимологии стали исследования, по- свящённые совершенствованию способов очистки ферментов и изучению их физико-химических свойств и механизма функционирования.

В 1894 г. немецкий химик Э. Г. Фишер предложил теорию специфич- ности действия ферментов. В 1897 г. французский биохимик Г. Э. Бертран обнаружил вещества, способствующие действию ферментов, и предложил называть их коэнзимами, или коферментами. В 1909 г. датский биохимик С. П. Сёренсен, который ввёл в научный оборот понятие «рН», установил зави- симость между активностью ферментов и концентрацией ионов водорода. В 1913 г. немецкий биохимик Л. Михаэлис вместе со своей сотрудницей канад- ским химиком М. Ментен сформулировал общую теорию кинетики фермен- тативных реакций.

 

В 1922 г. немецкий химик Р. М. Вильштеттер приступил к решению за- дачи получения ферментов в высокоочищенном состоянии и выяснению их химической природы. Для этих целей он усовершенствовал метод избира- тельной адсорбции, разработанный А. Я. Данилевским. Р. М. Вильштеттеру не удалось идентифицировать химическую природу ферментов, однако он сформулировал концепцию их двухкомпонентного строения: учёный пришёл к выводу, что ферменты представляют собой низкомолекулярные вещества особого рода, сорбированные на белках.

В 1926 г. американский биохимик Дж. Б. Самнер получил из семян тропического бобового растения канавалии фермент уреазу в кристалличе- ском виде и установил, что кристаллы этого фермента, расщепляющего мо- чевину на аммиак и углекислый газ, имеют белковую природу. В 1930 г. дру- гой американский биохимик Дж. Х. Нортроп получил белковые кристаллы фермента пепсина, а в 1931 г. вместе со своим коллегой М. Кунитцем — белковые кристаллы трипсина. Таким образом, в 30-е годы XX в. была неоп- ровержимо доказана белковая природа ферментов. С этого времени развитие энзимологии теснейшим образом стало связано с успехами белковой химии.

В последующие годы в энзимологии были достигнуты большие успехи в изучении структуры ферментов, показано, что многие из них являются двухкомпонентными и содержат в своём составе витамины, нуклеотиды, ме- таллы. Были также выяснены молекулярные механизмы биосинтеза фермен- тов в клетке и регуляции их действия.

В 1960 г. американскими биохимиками У. Стейном и С. Муром впер- вые была установлена первичная структура фермента рибонуклеазы подже- лудочной железы быка. В 1969 г. ещё одним американским биохимиком Р. Б. Меррифилдом был впервые осуществлён химический синтез этого фермента. Тем самым было показано решающее влияние первичной структуры белко- вой молекулы на определение её биологической функции.

В 1965 г. английским биофизиком Д. Филлипсом с помощью метода рентгеноструктурного анализа было впервые выяснено пространственное

 

строение (третичная структура) фермента лизоцима. Таким образом, впервые появилась возможность создания полной модели фермента.

В последующие годы были расшифрованы пространственные структу- ры целого ряда ферментов, осуществлён их лабораторный синтез. Было пока- зано, что многие ферменты обладают четвертичной структурой.

В 1970 г. был открыт фермент ревертаза, а в 1974 г. — ферменты рест- риктазы. Эти ферменты участвуют в процессах обмена нуклеиновых кислот, и их открытие дало мощный импульс развитию экспериментов в области генной инженерии. Благодаря использованию методов генной инженерии и молекулярной биологии появилась возможность не только «улучшать» свой- ства уже изученных ферментов, но и создавать новые, не существующие в природе.

В 1982 г. американский и канадский молекулярные биологи Т. Р. Чек и С. Олтмен независимо друг от друга обнаружили, что в качестве биокатали- заторов могут выступать не только белки, но и некоторые РНК, получившие название рибозимы. В настоящее время известно около ста таких РНК. Мно- гие из них катализируют расщепление различных молекул РНК. Кроме этого, оказалось, что рибозимами также являются рибосомальные РНК, т. к. именно они катализируют образование пептидной связи при синтезе белка в рибосо- ме. Открытие рибозимов пролило свет на вопрос о происхождении жизни на Земле.

Однако несмотря на значительные достижения в изучении ферментов, даже в наши дни многие вопросы, касающиеся понимания феномена биоло- гического катализа, ещё не получили ответа. Например, каким образом воз- никли ферменты? Почему именно белки играют роль главных катализаторов в клетках? Почему аминокислоты, сами по себе не способные ускорять хи- мические реакции, после соединения в специфические последовательности создают мощные каталитические системы? Как регулируется активность ферментов?

 

3.2.   Механизм ферментативной реакции

На пути любой химической реакции лежит энергетический барьер, раз- деляющий исходное и конечное состояния её участников. Поэтому химиче- ские реакции могут протекать лишь при условии, что реагирующие вещества преодолеют этот барьер, а для этого они должны приобрести определённую энергию.

Например, для протекания химической реакции типа АВ         А + В необходимо, чтобы молекулы вещества АВ располагали энергией, достаточ- ной для достижения вершины энергетического барьера (рис. 35).

 
   

Ход реакции

Рис. 35. Энергетическая схема химических реакций: 1 – некатализируемой АВ         А + В; 2 – катализируемой АВ + Е       А + В + Е

В исходном состоянии молекулы вещества АВ обладают неким средне- статистическим запасом энергии, которого, однако, недостаточно для начала химической реакции. Чтобы их перевести в реакционноспособное состояние, нужно затратить дополнительное количество энергии определённой величи- ны. Такой минимальный избыток энергии, превышающий её среднестатисти-

 

ческий запас, которым должен обладать 1 моль вещества для достижения им вершины энергетического барьера, называется энергией активации химиче- ской реакции. Величина энергии активации зависит от природы реагирую- щих веществ: её физический смысл заключается в возможности преодоления прочности химических связей в исходных молекулах. Эту величину обычно выражают в кДж/моль и обозначают символом Еа.

На вершине энергетического барьера образуется неустойчивая актив- ная форма молекул вещества А···В, находящихся в переходном состоянии, при котором процессы разрушения и создания химической связи уравнове- шены. Эта форма существует очень короткое время (примерно 10–13 с) и пре- образуется в исходные вещества или в продукты реакции.

Скорость любой химической реакции пропорциональна концентрации молекул, находящихся в переходном состоянии. Следовательно, скорость химической реакции будет высокой, если на вершине энергетического барье- ра будет находиться большая часть молекул вещества АВ.

Повысить скорость химической реакции можно двумя путями.

Первый путь — повышение температуры, т. е. ускорение теплового движения молекул, которое приводит к увеличению доли молекул, обладаю- щих достаточной энергией для достижения вершины энергетического барье- ра. Как правило, повышение температуры на 10 °С вызывает ускорение хи- мической реакции приблизительно в два раза.

Однако такой путь ускорения химических реакций в условиях живого организма невозможен, так как живая материя состоит в основном из органи- ческих веществ, которые характеризуются большой прочностью химических (ковалентных) связей, таких как С–С, С=О, С–N и других. Следовательно, энергия активации биологических веществ очень велика.

Наглядным примером, иллюстрирующим это положение, является ре- акция окисления глюкозы, для осуществления которой вне живой природы требуется температура горения глюкозы в кислороде, т. е. ≈ 500 °С:

 

С6Н12О6   +   6О2            6СО2  +   6Н2О

 

Понятно, что такого повышения температуры живой организм не вы- держит. Однако в клетках эта реакция протекает в мягких физиологических условиях.

Второй путь ускорения химической реакции — это снижение необхо- димой величины энергии активации добавлением катализатора. Именно этот способ и был реализован живой природой за счёт использования биоло- гических катализаторов — ферментов, т. к. реакции с их участием не требу- ют больших дополнительных затрат энергии.

Ферменты значительно повышают скорость химических реакций, ко- торые при тех же условиях в отсутствие фермента протекают очень медлен- но. Ферменты не могут влиять на положение равновесия между прямой и об- ратной реакциями, они лишь ускоряют наступление этого равновесия. При этом в ходе реакции ферменты не расходуются и не претерпевают необрати- мых изменений.

Любая ферментативная реакция протекает в два этапа. На первом этапе молекула фермента Е взаимодействует с молекулой исходного соединения, называемого субстратом S, в результате чего образуется фермент-субстрат- ный комплекс ЕS. Затем комплекс ЕS может распадаться на фермент Е и субстрат S или на фермент Е и продукты реакции Р. Как правило, условия в клетке таковы, что равновесие биохимических превращений сдвинуто в сто- рону образования продуктов реакции. Этот процесс можно описать следую- щим уравнением, называемым общим уравнением ферментативного ката- лиза:

E   +   S           ES           E   +   P

 

Долгое время не удавалось доказать экспериментально образование фермент-субстратного комплекса ЕS, поскольку фермент вступает в соеди- нение с субстратом на очень короткий срок, составляющий доли секунды, и этот комплекс крайне неустойчив.

 

Образовавшемуся промежуточному соединению (см. рис. 35) — фер- мент-субстратному комплексу ЕА···В (ES) соответствует значительно более низкая величина энергии активации по сравнению с переходным состоянием активированных молекул вещества А···В в некатализируемой реакции.

Снижение энергии активации в условиях ферментативного катализа объясняется тем, что при образовании промежуточного фермент-субстратно- го комплекса происходит некоторая деформация молекулы субстрата, вслед- ствие чего в нём ослабевают внутримолекулярные связи и молекула стано- вится более реакционноспособной. Таким образом, понижение энергии акти- вации происходит в момент образования промежуточного соединения фер- мента с субстратом вследствие деформации последнего. Чем сильнее фер- мент снижает энергию активации, тем легче протекает катализируемая им реакция.

При этом, однако, следует помнить, что реакция, катализируемая фер- ментом, не идентична некатализируемой реакции. Это уже совершенно иная реакция, имеющая более низкий активационный барьер. Поэтому правильнее говорить, что ферменты ускоряют химические реакции, направляя их «об- ходным путём» через образование промежуточного соединения фермента с субстратом, позволяющего молекулам преодолевать энергетический барьер на более низком энергетическом уровне.

Итак, ферменты обладают всеми общими свойствами химических ка- тализаторов небелковой природы. Однако в отличие от обычных катализато- ров ферменты являются белками и поэтому обладают рядом особенностей, отличающих их от небиологических катализаторов.

 

3.3.   Особенности ферментов как биологических катализаторов

Одной из особенностей ферментов как биологических катализаторов является мощная сила их каталитического действия, в десятки и сотни тысяч раз превосходящая силу действия небиологических катализаторов.

 

Сравним эффективность действия ферментов и небиологических ката- лизаторов на примере реакции разложения пероксида водорода на воду и ки- слород:

2О2           2Н2О  +   О2

Эта реакция может катализироваться ионами железа Fe3+, а также со- держащим железо ферментом каталазой. В таблице 8 приведены данные, ко- торые ясно показывают, насколько выше эффективность ферментативного катализа по сравнению с неферментативным.

Таблица 8 Снижение катализаторами энергии активации, необходимой

для разложения Н2О2 на воду и кислород

 

 

Катализатор

Энергия

активации, кДж/моль

Число молей Н2О2, разложенное за 1 с

при 0 °С под воздействием катализа- тора, содержащего 1 моль железа

Отсутствует

75

FeО(ОН)

42

10–5

Фермент каталаза

7

105

 

Как видно, 1 моль железа в составе неорганического катализатора — гидрата окиси железа (III) FeО(ОН) обладает низкой эффективностью: в те- чение 1 секунды при 0 °С он катализирует разложение всего лишь 0,00001 моль пероксида водорода. Каталаза же, в пересчёте на 1 моль железа, за 1 се- кунду при тех же самых условиях катализирует расщепление 100000 моль пероксида водорода. Следовательно, 1 моль железа в составе фермента ката- лазы в десять миллиардов раз более эффективен как катализатор разложения пероксида водорода, чем 1 моль железа в составе неорганического катализа- тора.

Вследствие огромной силы каталитического действия, содержание ферментов в клетках и тканях живых организмов очень мало. Поэтому о ко- личестве фермента судят по скорости химической реакции, которую он ката-

 

лизирует, т. е. по его активности. Чаще всего активность фермента опреде- ляют по количеству образовавшихся продуктов реакции в единицу времени.

Другой важнейшей особенностью, отличающей ферменты от небиоло- гических катализаторов, является высокая специфичность их действия. Если действие небиологических катализаторов (Pt, Fe, Ni и т. д.) универсаль- но, и они способны ускорять тысячи всевозможных превращений химиче- ских веществ различной структуры, то ферменты среди огромного числа ор- ганических соединений «узнают» свой субстрат и взаимодействуют только с ним. Более того, каждый фермент в отличие от неорганических катализато- ров ускоряет строго определённую реакцию.

Таким образом, ферменты проявляют специфичность действия одно- временно и по отношению к химической природе субстратов, и по отноше- нию к типам катализируемых реакций. В связи с этим различают, соответст- венно, субстратную и реакционную специфичность действия ферментов.

Некоторые ферменты обладают абсолютной субстратной специфич- ностью, т. е. воздействуют лишь на один-единственный субстрат. В живых организмах, однако, такие ферменты встречаются редко; к их числу принад- лежат, например, каталаза и уреаза:

уреаза

H2N – C – NH2  +   H2O                  CO2   +   2NH3

|| O

Мочевина

 

Подавляющее большинство ферментов проявляет относительную, или групповую, субстратную специфичность: они воздействуют на группу суб- стратов, имеющих однотипное химическое строение. Для таких ферментов важны лишь тип разрушаемой или создаваемой химической связи в молекуле субстрата, а также химическая структура присутствующих в нём определён- ных молекулярных группировок. Ферментами, проявляющими групповую специфичность, являются, например, пепсин и трипсин, катализирующие

 

расщепление пептидных связей в белках, или липаза, катализирующая раз- рушение сложноэфирных связей в жирах.

Особым случаем субстратной специфичности является стереохимиче- ская специфичность, когда при наличии у субстрата нескольких стереоизо- мерных форм фермент катализирует превращение лишь одной из них. На- пример, фермент аспарагиназа катализирует гидролитическое отщепление амидной группы только от L-аспарагина и не действует на D-аспарагин:

аспарагиназа

H2N–СН–СООН  +   Н2О                              H2N–СН–СООН  +   NH3

|                                                                      |

СН2                                                                СН2

|                                                                       |

СОNН2                                                           СООН

L-Аспарагин                                      L-Аспарагиновая кислота

 

Стереохимическая специфичность действия ферментов теснейшим об- разом связана с одной из основных особенностей живых организмов — спо- собностью синтезировать аминокислоты, моносахариды и другие асиммет- ричные молекулы в форме пространственных изомеров, принадлежащих ли- бо только к L-, либо только к D-ряду.

Существуют и другие типы стереоспецифического действия фермен- тов. Так, например, в процессах углеводного обмена большую роль играет стереоспецифическое расщепление ферментами гликозидных связей в раз- личных субстратах: α-гликозидных связей — только α-гликозидазами, а β- гликозидных связей — только β-гликозидазами.

Стереохимическая специфичность действия ферментов может быть как абсолютной, так и относительной.

Как правило, одно и то же химическое соединение является субстратом для нескольких ферментов. Однако вследствие высокой реакционной спе- цифичности ферментативного катализа, выражающейся в способности каж- дого фермента катализировать только определённую химическую реакцию, превращение субстрата под воздействием одного фермента всякий раз про-

 

исходит по одному и тому же «своему» пути. Следовательно, под влиянием различных ферментов один и тот же субстрат подвергается различным пре- вращениям, приводящим к образованию совершенно разных продуктов.

Такая высокая степень специфичности действия ферментов является одной из важнейших особенностей живой материи. Только благодаря этой тончайшей специфичности ферментативного катализа обеспечивается стро- гая упорядоченность и направленность протекания биохимических процессов в клетке, а также теснейшая взаимосвязь отдельных ферментативных реак- ций, которые в своём сочетании создают уникальный биологический обмен веществ.

Причина высокой избирательности ферментативного катализа кроется в белковой природе и уникальной структурной организации молекулы фер- мента. Как и все белки, ферменты являются высокомолекулярными вещест- вами (молекулярная масса белков колеблется от 6 тыс. до 1 млн дальтон и более), и поэтому их размеры намного превышают размеры субстратов или тех функциональных групп, на которые они воздействуют. Следовательно, во взаимодействии с субстратом принимает участие лишь небольшая часть хи- мических группировок молекулы фермента, которая получила название ак- тивного центра фермента.

Активный центр фермента формируется на уровне третичной структу- ры ферментного белка, когда в результате специфического свёртывания по- липептидной цепочки в глобулу сближаются химические группы, ответст- венные за образование активного центра (рис. 36). В случае ферментных бел- ков, обладающих четвертичной структурой, при создании активного центра дополнительно используются возможности, заложенные в этой структуре. Как правило, активный центр располагается в углублении поверхности фер- мента, по форме напоминающем нишу или щель.

Таким образом, активный центр фермента представляет собой комби- нацию нескольких функциональных групп белка, строго определённым обра- зом расположенных в пространстве относительно друг друга и обеспечи-

 

вающих взаимодействие фермента с субстратом, благодаря чему осуществ- ляется его каталитическое действие.

 

 

Н2N                                          СООН                                                    СООН Н2N

Rx                  Ry

 

Рис. 36. Образование активного центра фермента

(Rx и Ry — химические группировки, образующие активный центр)

 

Конфигурация активного центра фермента определяет возможность присоединения к нему конкретного субстрата и образования промежуточного фермент-субстратного комплекса. Следовательно, специфичность действия ферментов обуславливается наличием геометрического соответствия струк- туры активного центра фермента структуре молекулы субстрата.

Представление о необходимости строгого структурного соответствия друг другу участников образования промежуточного комплекса ЕS нашло отражение в образном выражении Э. Г. Фишера о том, что активный центр фермента соответствует своему субстрату как ключ — замку (рис. 37). Взаимодействие фермента с субстратом в соответствии с этим знаменитым правилом является одним из многочисленных примеров реализации принци- па комплементарности (лат. “complementum” — дополнение) в живой приро- де.

 

 

 

+                                                                          +     +

 

S

Р

E                                          ES                           E

Рис. 37. Схема взаимодействия субстрата с ферментом согласно теории стро- гого соответствия активного центра фермента субстрату

 

С помощью гипотезы «ключа и замка» Э. Г. Фишера хорошо объясни- мо явление абсолютной субстратной специфичности действия ферментов, однако явление групповой специфичности с её помощью объяснить трудно.

В развитие идей Э. Г. Фишера американским биохимиком Д. Э. Кош- ландом было высказано предположение, что строгое структурное соответст- вие активного центра фермента субстрату возникает лишь в момент их взаи- модействия. Пока фермент находится в изоляции от субстрата, его активный центр лишь приблизительно комплементарен субстрату, полная же компле- ментарность возникает лишь при образовании промежуточного комплекса ES. Это положение было подтверждено экспериментально и получило назва- ние теории индуцированного (лат. “inductio” — возбуждение) соответствия, согласно которой активный центр фермента соответствует субстрату также как резиновая перчатка — кисти руки (рис. 38).

 

 

 

+                                                                          +   

 

S

Р

E                                          ES                            E

Рис. 38. Схема взаимодействия субстрата с ферментом согласно теории ин- дуцированного соответствия активного центра фермента субстрату

 

Гипотеза Д. Э. Кошланда не только объясняет явление групповой суб- стратной специфичности действия ферментов, но и хорошо согласуется с ещё одной их важной особенностью — неустойчивостью, или лабильностью (лат. “labilis” — скользящий). В этом отличительном свойстве наиболее ярко проявляется белковая природа ферментов, молекулы которых под влиянием разнообразных факторов способны существенно изменять свою нативную конформацию. При этом происходит изменение конформации активного центра фермента, которое влечёт за собой изменение его способности при-

 

соединять субстрат, а следовательно, и каталитической активности фермента. Таким образом, ферменты являются катализаторами с регулируемой актив- ностью.

Пространственная структурная организация ферментов может значи- тельно меняться под влиянием изменения температуры, рН среды, присутст- вия в клетке или растворе каких-либо химических веществ. Рассмотрение во- просов влияния этих и других факторов на каталитическую активность фер- ментов составляет предмет ферментативной кинетики.

 

  • 4. Основы ферментативной кинетики Ферментативная кинетика представляет собой особый раздел хими-

ческой кинетики (греч. “χινητιχός” — приводящий в движение) — науки о скоростях химических реакций, который посвящён изучению закономерно- стей влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций. Выделение ферментативной кинетики в специальный раздел кинетики хими- ческих реакций связано с тем, что кинетика ферментативных реакций имеет целый ряд особенностей, связанных с уникальностью ферментов, как катали- заторов особого рода, хотя многие закономерности, свойственные кинетике химических реакций, распространяются и на ферментативные реакции.

Скорость катализируемой ферментом реакции, как и любой химиче- ской реакции, зависит от природы реагирующих веществ и условий их взаи- модействия. При заданных внешних условиях, т. е. при постоянных темпера- туре, давлении и составе реакционной среды, скорость химической реакции зависит лишь от природы и концентрации реагирующих веществ.

Нахождение скорости ферментативной реакции является практически единственно возможным способом получения информации о ферменте. Её определяют экспериментально по скорости накопления продуктов реакции, либо по скорости убывания субстрата, обозначают буквой υ и обычно выра- жают в мг/мин, мкмоль/мин или аналогичных единицах.

 

При описании кинетики химических процессов, катализируемых фер- ментами, используют такие понятия, как реакции нулевого, первого и второ- го порядков. Напомним, что физический смысл порядка химической реак- ции заключается в том, что он равен числу тех реагирующих веществ, изме- нение концентраций которых в ходе реакции приводит к изменению её ско- рости.

Скорость реакций нулевого порядка не зависит от изменения концен- трации реагирующих веществ и со временем не изменяется. Другими слова- ми, при уменьшении концентрации реагирующих веществ, например, в два или три раза, скорость реакции остаётся неизменной (20 = 1, 30 = 1). В таких реакциях зависимость количества образовавшегося продукта от времени яв- ляется прямо пропорциональной (рис. 39).

 

P, мг

 

 

 

 

 

 

τ, мин

Рис. 39. Графическое изображение реакции нулевого порядка

 

Скорость реакции первого порядка в каждый момент времени прямо пропорциональна имеющейся в наличии концентрации реагирующего веще- ства: при её уменьшении в два или три раза скорость реакции снижается так- же в два или три раза соответственно (21 = 2, 31 = 3). Следовательно, наблю- дается линейное падение скорости реакции с течением времени (рис. 40).

В случае реакций второго порядка при уменьшении концентраций реагирующих веществ в два или три раза скорость реакции снижается соот- ветственно в четыре или девять раз (22 = 4, 32 = 9). В этом случае наблюдает- ся квадратичное падение скорости реакции с течением времени.

 

P, мг

 

 

 

 

 

 

τ, мин

Рис. 40. Графическое изображение реакции первого порядка

 

Ферментативные реакции, в большинстве случаев, в самом начале сво- его протекания (когда ещё имеется избыток субстрата и образовалось мало продуктов реакции) являются реакциями нулевого порядка, а затем они при- обретают характер реакций первого или второго порядка. Таким образом, ферментативные реакции представляют собой реакции смешанного поряд- ка, и поэтому их ход во времени не может быть описан одним математиче- ским уравнением.

На рис. 41 представлена кривая, описывающая ход ферментативной ре- акции во времени. Вначале кривая круто поднимается вверх, затем её подъём замедляется.

 

P, мг

 

 

 

 

 

 

 

τ, мин

Рис. 41. Графическое изображение хода ферментативной реакции во времени

 

Описанный характер кривой свидетельствует о замедлении фермента- тивной реакции в течение времени её протекания. Это явление может вызы- ваться многими причинами, среди которых основными являются следующие три:

 

  • 1) уменьшение концентрации субстрата, поскольку он потребляется в процессе реакции;
  • 2) специфическое торможение продуктами реакции, которые могут быть ингибиторами данного фермента, либо неспецифическое торможение по закону действующих масс;
  • 3) частичная тепловая инактивация фермента во время реакции. Поэтому для того, чтобы правильно установить потенциальные воз-

можности данного фермента как катализатора, нужно определить скорость ферментативной реакции в тот момент, когда все вышеперечисленные фак- торы не играют роли, т. е. в начале реакции, когда имеется избыток субстра- та, продуктов реакции образовалось очень мало и ещё не началась инактива- ция фермента.

Скорость катализируемой ферментом реакции, которую определяют в самом начале её протекания, когда ещё наблюдается прямо пропорциональ- ная зависимость количества образующихся продуктов реакции от времени, называют начальной скоростью ферментативной реакции и обозначают υ0. Если прямолинейный участок очень мал и трудно улавливается, началь- ную скорость определяют по тангенсу угла наклона касательной, проведён- ной из начала координат к экспериментальной кривой хода ферментативной реакции во времени: υ0 = tg α (см. рис. 41).

При работе с конкретным ферментом длительность проведения реак- ции всегда следует выбирать, исходя из экспериментальных данных по её на- чальной скорости, помня, что по мере протекания ферментативной реакции её скорость будет всё время уменьшаться.

Начальная скорость ферментативной реакции сильно зависит от кон- центрации субстрата и фермента, а также условий их взаимодействия — тем- пературы, рН среды, присутствия в реакционной среде тех или иных химиче- ских веществ.

 

3.4.1.   Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость реакции

При постоянной концентрации фермента [E] по мере увеличения кон- центрации субстрата [S] скорость реакции υ0 растёт, но до определённого предела (рис. 42). Сначала скорость реакции возрастает пропорционально росту концентрации субстрата. Однако затем эта пропорциональность нару- шается, скорость реакции достигает максимального уровня и уже перестаёт зависеть от концентрации субстрата.

 

υ0, мг/мин

 

 

 

 

 

 

[S], мг/мл

Рис. 42. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата

 

Своей максимальной величины скорость ферментативной реакции дос- тигает при такой концентрации субстрата [S], когда все активные центры фермента насыщаются субстратом, т. е. когда концентрация фермент- субстратного комплекса [ES] равна концентрации всего имеющегося фер- мента [E]. Поэтому дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не приводит к увеличению скорости реакции.

Максимальную скорость реакции обозначают Vmax (см. рис. 8), а кон- центрацию субстрата при Vmax называют насыщающей концентрацией суб- страта. Для данной концентрации фермента Vmax является постоянной вели- чиной, не зависящей от концентрации субстрата. При определении характер- ных свойств того или иного фермента все исследования следует проводить при насыщающей концентрации субстрата.

Явление насыщения фермента субстратом — важная особенность фер- ментативных реакций, не свойственная обычным химическим реакциям.

 

Другой особенностью ферментативных реакций является и то, что ско- рость их протекания находится в прямой зависимости от концентрации фер- мента, тогда как скорость реакций неферментативного катализа от концен- трации катализатора практически не зависит.

При насыщающих концентрациях субстрата (обеспечивающих Vmax) скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рис. 43). Это свидетельствует о том, что начальная скорость реак- ции является мерой количества фермента.

 

Vmax, мг/мин

 

 

 

[E], мг белка/мл

Рис. 43. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента

 

Кинетику ферментативных реакций всегда изучают на модельных сис- темах. Однако специалисты пищевых производств имеют дело с фермента- тивными реакциями, протекающими в ходе реального технологического про- цесса, и поэтому им приходится считаться с его особенностями и потребно- стями. В действительности фермент может находиться далеко не в опти- мальных условиях, функционировать не с начальной скоростью, субстрат может иметь сложный состав и т. д.

Поэтому технолог должен уметь находить ту тонкую грань в создавае- мых условиях (температура, рН среды и т. д.), которая по возможности по- зволяла бы улучшать действие фермента без ухудшения параметров и, глав- ное, результатов технологического процесса.

 

3.4.2.   Влияние температуры и рН среды на активность ферментов

Температура является важнейшим фактором, влияющим на каталити- ческую активность ферментов. Это влияние весьма сложно, что объясняется

целым рядом причин.

 

Как известно, при повышении температуры скорость химических реак- ций возрастает, так как увеличивается скорость движения реагирующих час- тиц. Это справедливо и для ферментативных реакций, но лишь отчасти (рис. 44).

В ходе ферментативной реакции с повышением температуры возраста- ет частота столкновений молекул фермента и субстрата друг с другом. В ре- зультате увеличивается вероятность образования фермент-субстратного ком- плекса и, как следствие, — продуктов реакции, что свидетельствует о росте каталитической активности фермента.

Активность фермента Vmax, мг/мин

 

 

 

 

50          t, °С

Рис. 44. Влияние температуры на активность фермента

 

При определённой температуре, называемой оптимальной, активность фермента достигает своего максимума. Для большинства ферментов темпе- ратурный оптимум находится в пределах 40–50 °С, причём для каждого фер- мента его величина не является константой. Она зависит, например, от дли- тельности реакции. При продолжительных реакциях оптимальная температу- ра сдвигается в сторону более низких значений и, наоборот, при краткосроч- ных реакциях температурный оптимум сдвигается в сторону более высоких температур.

При повышении температуры выше оптимального значения, несмотря на ещё большее увеличение частоты столкновений молекул фермента и суб- страта друг с другом, начинается быстрое снижение скорости ферментатив- ной реакции, а затем и её полное прекращение. Это явление объясняется, прежде всего, происходящей денатурацией ферментного белка, в результате

 

которой нарушается пространственная структурная организация молекул фермента и, как следствие этого процесса, разрушается структура активного центра фермента. Наиболее чувствительными к повышению температуры яв- ляются водородные связи и гидрофобные взаимодействия.

Таким образом, температура оказывает влияние не только непосредст- венно на скорость ферментативных реакций, но и на стабильность самих ферментов, что отличает их от неорганических катализаторов.

Другим фактором, оказывающим очень сильное влияние на каталити- ческую активность ферментов, является рН среды.

Каждый фермент эффективно работает лишь в определённом диапазо- не значений реакции среды, внутри которого существует интервал её опти- мальных значений, когда фермент проявляет максимальную активность (рис. 45).

 

Активность фермента Vmax, мг/мин

 

 

 

рНopt          рН

Рис. 45. Влияние рН среды на активность фермента

 

Для каждого фермента существует своя область оптимальных значений рН среды. Так, например, оптимум действия фермента пепсина находится при рН 1,5–2,0, солодовой амилазы — при рН 4,7–5,2, а трипсина — при рН 8,0–9,0 (рис 46). Оптимум рН среды, также как и температурный оптимум, не является константной величиной для действия данного фермента и зависит от условий протекания реакции.

По мере отклонения рН среды от оптимальных для действия данного фермента значений в кислую или в щелочную сторону его каталитическая активность начинает быстро ослабевать и затем полностью прекращается.

 

Активность фермента, %

100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1   2   3   4   5   6   7   8   9  10 11 12 13 14  рН

Рис. 46. Зависимость действия различных ферментов от рН среды

 

Влияние рН среды на ферментативную активность обусловлено, в пер- вую очередь, ионизацией фермента. Изменение реакции среды вызывает из- менение степени диссоциации и протонирования различных химических групп молекулы ферментного белка и, следовательно, её суммарного заряда, что влечёт за собой изменение конформации полипептидной цепи. Это ска- зывается на способности фермента присоединять субстрат. Особенно силь- ное влияние на этот процесс оказывает изменение заряда химических групп, расположенных в активном центре фермента.

Таким образом, каждый фермент может существовать в нескольких различных ионных формах, переходящих друг в друга при изменениях рН среды. При этом каталитической активностью обладает лишь одна из воз- можных ионных форм фермента, поскольку его взаимодействие с субстратом может происходить лишь при каком-то определённом состоянии ионизации ферментного белка.

Поэтому даже небольшие сдвиги реакции среды в сторону от её опти- мальных значений вызывают замедление скорости ферментативной реакции, так как они приводят к снижению доли каталитически активной формы фер- мента.

Изменение рН среды влияет не только на соединение фермента с суб- стратом и образование комплекса ES, но и на расщепление этого комплекса на фермент и продукт реакции, которое может происходить также лишь при

 

каком-то определённом состоянии ионизации фермент-субстратного ком- плекса.

Наконец, при экстремальных значениях рН среды может нарушаться стабильность молекул фермента вследствие денатурации пространственной структурной организации полипептидных цепей. В таких случаях ферменты полностью теряют свою каталитическую активность.

Тем не менее существуют ферменты, адаптированные к работе в усло- виях экстремальных значений реакции среды. Одним из таких ферментов яв- ляется пепсин, сохраняющий свою структуру в условиях высокой кислотно- сти. Как известно, денатурация белков в этих условиях вызвана обилием по- ложительных зарядов на их поверхности, взаимное отталкивание которых приводит к развёртыванию глобул. С молекулой пепсина этого не происхо- дит, так как в ней почти полностью отсутствуют химические группы, спо- собные приобретать в кислой среде положительный заряд.

Таким образом, кривые, изображённые на рис. 45 и 46, являются отра- жением сложного характера влияния рН среды на совокупность факторов, от которых зависит скорость ферментативной реакции.

 

3.4.3.   Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Действие ферментов можно усилить или ослабить некоторыми хими- ческими реагентами. Вещества, в присутствии которых активность фермен- тов возрастает, называют активаторами; вещества, снижающие каталитиче- ское действие ферментов, называют ингибиторами.

Важнейшими природными активаторами являются аминокислота цис- теин и восстановленный глутатион — цистеинсодержащий трипептид. Они содержат свободную сульфгидрильную группу (SН-группу) и поэтому спо- собны активировать тиоловые ферменты, в активном центре которых тоже содержится сульфгидрильная группа. При окислении этой группы тиоловые ферменты теряют своё каталитическое действие и вновь начинают работать после её восстановления. Активирующее воздействие восстановленного глу-

 

татиона и цистеина состоит в том, что они, окисляясь, способны восстанав- ливать SН-группу тиоловых ферментов. Схематично процесс активирования тиоловых ферментов цистеином выглядит так:

 

 

E–S–S–Ц

+

Ц–SН

E–SН

+

Ц–S–S–Ц

Фермент–цистеин (неактивная форма)

 

Цистеин

Фермент (активная форма)

Цистин

 

Активирующее воздействие на многие ферменты могут оказывать так- же ионы различных металлов в низких концентрациях, такие как Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+, Co2+ и др. Так, например, ионы Ca2+ усиливают актив- ность фермента липазы, катализирующей гидролиз жиров, ионы Zn2+ активи- руют фермент алкогольдегидрогеназу, катализирующую окисление этанола до уксусного альдегида, а ионы Fe2+ — ферменты каталазу и пероксидазу, ка- тализирующие разложение пероксида водорода.

Увеличение активности ферментов под воздействием ионов металлов в одних случаях связано с тем, что они входят непосредственно в состав ак- тивного центра фермента (каталаза, пероксидаза), в других — принимают участие в образовании фермент-субстратного комплекса (алкогольдегидро- геназа), в третьих — способствуют поддержанию специфической каталити- чески активной конформации молекулы фермента и в первую очередь его ак- тивного центра (липаза) и т. д.

Степень и характер влияния активирующих ионов на скорость фермен- тативной реакции зависит от их концентрации в реакционной среде. Если концентрация ионов-активаторов ниже оптимальной, то её повышение будет способствовать росту каталитической активности ферментов. При оптималь- ной концентрации активирующих ионов наблюдается максимальная скорость ферментативной реакции. Небольшое повышение концентрации ионов- активаторов выше оптимального значения приводит к снижению их активи- рующего воздействия на ферменты, а присутствие в реакционной среде зна-

 

чительного избытка активирующих ионов вызывает ингибирование фермен- тативной активности.

Ингибиторы (лат. “inhibeo” — торможу, сдерживаю) специфически замедляют либо полностью прекращают протекание ферментативной реак- ции. Если снижение или полная потеря каталитической активности фермента вызваны какими-либо денатурирующими воздействиями, например больши- ми концентрациями солей тяжёлых металлов, трихлоруксусной кислотой, ор- ганическими растворителями и др., то такой процесс называют не ингибиро- ванием, а инактивацией фермента, т. к. такого рода воздействия подавляют действие любого фермента и, следовательно, являются неспецифическими.

В зависимости от прочности соединения ингибитора с ферментом раз- личают два типа ингибирования: обратимое и необратимое.

При необратимом ингибировании ингибитор ковалентно связывается с функциональной группой молекулы фермента, необходимой для проявле- ния его каталитической активности, в результате чего фермент перестаёт функционировать.

Необратимое ингибирование вызывает, например, диизопропилфтор- фосфат (ДФФ), который может необратимо связываться с ОН-группой ами- нокислоты серина, располагающейся в активном центре сериновых фермен- тов:

 

CH3                                          CH3

O–CH                                      O–CH

|             CH3                            |             CH3

E–OH    +     F–P=O                                 E–O–P=O                  +     HF

|             CH3                             |             CH3

O–CH                                      O–CH

CH3                                           CH3

Активный              ДФФ                         Неактивное соединение фермент                                                          фермент–ДФФ

 

К сериновым ферментам принадлежат трипсин, катализирующий гид- ролиз полипептидных цепочек, а также ацетилхолинэстераза, катализирую-

 

щая гидролитический распад ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Последняя реакция происходит всякий раз после передачи нервного импуль- са и предшествует передаче следующего импульса. Поэтому диизопропил- фторфосфат представляет собой отравляющее вещество нервнопаралитиче- ского действия, т. к. после ингибирования каталитической активности аце- тилхолинэстеразы передача нервных импульсов становится невозможной. Помимо ДФФ, ингибиторами ацетилхолинэстеразы являются многочислен- ные инсектициды, применяемые для борьбы с вредителями сельскохозяйст- венных культур, а также боевые отравляющие вещества (зарин, зоман и др.).

Другим примером необратимого ингибирования является действие си- нильной кислоты HCN и её солей, в т. ч. цианистого калия KCN, на фермен- ты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции и содержа- щие в активном центре железо или медь. Ингибирующее воздействие этих веществ объясняется тем, что CN-группа необратимо связываясь с металлом, блокирует активный центр ферментов, в результате чего они теряют свою ак- тивность. Так как ионы железа входят в состав дыхательных ферментов, циа- ниды подавляют процесс дыхания; поэтому их называют дыхательными яда- ми.

При обратимом ингибировании ингибитор связывается с ферментом менее прочно, чем при необратимом. Различают два механизма обратимого ингибирования: конкурентное и неконкурентное.

Конкурентное ингибирование заключается в том, что ингибитор об- ратимо связывается с тем же местом в молекуле фермента, с которым обычно связывается субстрат, т. е. с активным центром.

Согласно теории ферментативного катализа образование соединения фермент–субстрат обеспечивается наличием структурного соответствия ме- жду молекулами фермента и субстрата. Затем в ходе реакции фермент- субстратный комплекс распадается, причём возникают продукты реакции, а молекула фермента регенерируется в неизменном виде (рис. 47 а).

 

Конкурентные ингибиторы своей трёхмерной структурой обычно на- поминают структуру субстрата данного фермента. Благодаря такому сходст- ву конкурентному ингибитору удаётся «обмануть» фермент и связаться с ним вместо субстрата. Однако в отличие от субстрата ингибитор не подвергается воздействию фермента, и новые продукты реакции не образуются (рис. 47 б). При таком механизме ингибирования скорость катализа уменьшается в ре- зультате снижения доли молекул фермента, которые могут взаимодейство- вать с субстратом. Отличительная особенность конкурентного ингибирова- ния состоит в том, что его можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата.

 

а)

 

 

+                                                                         +    

 

S

Р

E                                           ES                           E

 

б)

 

 

 

+             +                                            +

 

I             S                                              S

Ингибитор

E                                                        EI — каталитически неактивный

комплекс фермент–ингибитор

 

Рис. 47. Механизм конкурентного ингибирования:

а – протекание реакции в отсутствие ингибитора; б – ингибирование реакции конкурентным ингибитором

 

Классическим примером конкурентного ингибирования служит инги- бирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Этот фермент ката- лизирует реакцию окисления янтарной кислоты до фумаровой:

 

СООН

 

СООН

|

 

|

СН2

|

сукцинатдегидрогеназа

СН

||

СН2

|

– 2Н

СН

|

СООН

 

СООН

Янтарная кислота                                            Фумаровая кислота

 

Малоновая кислота НООС–СН2–СООН является структурным анало- гом янтарной кислоты и отличается от неё только на одну метиленовую группу. Поэтому малоновая кислота связывается с активным центром сукци- натдегидрогеназы вместо янтарной кислоты, образуя неактивный комплекс фермент–ингибитор. В результате скорость превращения янтарной кислоты в фумаровую резко понижается. Однако при введении в реакционную среду большого количества янтарной кислоты она вытесняет малоновую кислоту  из активного центра фермента, в результате чего каталитическая активность сукцинатдегидрогеназы быстро восстанавливается.

Конкурентным ингибированием объясняется также явление ингибиро- вания ферментативной активности повышенными концентрациями ионов ме- таллов, которые в малых количествах выполняют функцию активаторов ферментов. Дело в том, что ионы металлов-активаторов часто служат «мос- тиками», через которые субстрат присоединяется к активному центру фер- мента, образуя комплекс EMeS. Образование этого комплекса происходит в два этапа: сначала субстрат соединяется с ионом металла, а уже затем MeS взаимодействует с E. В условиях избытка ионов металлов в больших количе- ствах образуется также их соединение с ферментом EMe. А поскольку EMe и MeS не могут взаимодействовать с образованием комплекса EMeS, каталити-

 

ческая активность ферментов понижается. При повышении концентрации субстрата ферментативная активность восстанавливается.

При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с фер- ментом не в области активного центра, где связывается субстрат, а на неко- тором удалении от него, в другой области молекулы фермента. При этом об- разуется каталитически неактивный комплекс фермент–ингибитор, причём никаким избытком субстрата ингибитор из комплекса не удаляется. При взаимодействии ингибитора с ферментом происходит изменение конформа- ции последнего с последующей частичной деформацией активного центра, что препятствует образованию фермент-субстратного комплекса.

Неконкурентное ингибирование ферментативной активности вызывают малые концентрации ионов тяжёлых металлов, например Hg2+, Ag+, As3+, ко- торые блокируют SH-группы полипептидных цепей молекул ферментов.

Важным примером неконкурентного ингибирования каталитической активности ферментов является аллостерическое ингибирование, играющее огромную роль в регуляции метаболических процессов в клетке.

 

3.5.   Регулирование активности ферментов

3.5.1.   Аллостерические ферменты

Существует большое число ферментов, у которых помимо активного центра имеется ещё и так называемый аллостерический (греч. “άλλος” — другой + “στερεός” — пространственный) центр. Такие ферменты получили название аллостерических. Белковые молекулы этих ферментов обладают четвертичной структурой, т. е. состоят из нескольких субъединиц, что обу- славливает пространственную обособленность друг от друга активного и ал- лостерического центров.

К аллостерическому центру фермента могут присоединяться опреде- лённые химические вещества — эффекторы, которые вызывают изменение пространственной конформации молекулы ферментного белка и, как следст- вие, изменение каталитической активности фермента. Одни эффекторы могут

 

действовать как активаторы, другие — как ингибиторы ферментативной ак- тивности.

Присоединение к аллостерическому центру фермента активатора (рис. 48 а) вызывает изменение пространственной конформации молекулы фер- ментного белка, приводящее к такой перестройке его активного центра, ко- торая способствует сближению и взаимодействию субстрата и фермента, а следовательно, повышает ферментативную активность.

Связывание с аллостерическим центром фермента ингибитора (см. рис. 48 б) вызывает изменение нативной конформации молекулы ферментного белка и такую перестройку его активного центра, которая, напротив, делает невозможным присоединение к нему субстрата и, как следствие, приводит к потере ферментом своей активности.

Субстрат                                               Субстрат

 

Активный центр                                                   Активный центр (правильная                                                               (неправильная

конформация                                                             конформация

для субстрата)                                                          для субстрата)

Активный фермент                                             Неактивный фермент

 

Активатор                                                               Ингибитор

 

Место связывания                                                 Место связывания

активатора                                                              ингибитора

а)                                                              б)

Рис. 48. Механизм взаимодействия аллостерического фермента с эффектора- ми и субстратом: а – активный комплекс; б – неактивный комплекс

 

Так, взаимодействием с различными эффекторами, осуществляется ре- гуляция каталитической активности аллостерических ферментов.

В роли эффекторов в клетке могут выступать различные продукты об- мена веществ, которые образуются, как правило, в результате цепи биохими- ческих превращений. Каждая реакция биохимического процесса протекает при участии определённого фермента, и все ферменты функционируют в строго заданной последовательности, например:

 

E1                E2               E3              E4              En

S         P1         P2         P3        ···         Pn

 

В данной цепи биохимических превращений продукт предыдущей ре- акции является субстратом для последующей. Так, например, вещество P1 является субстратом для реакции, катализируемой ферментом E2. Вещество Pn в рассматриваемом примере является конечным продуктом во всей цепи метаболических превращений.

Если в какой-то определённый момент времени в клетке накопился из- быток вещества Pn, то его синтез необходимо остановить. Такая остановка произойдёт в том случае, если вещество Pn является ингибитором аллостери- ческого фермента E1, катализирующего первую реакцию в цепи биохимиче- ских превращений, приводящих к синтезу вещества Pn. Избыток вещества Pn связывается с аллостерическим центром молекулы фермента E1. В результате этого взаимодействия фермент E1 ингибируется и, как следствие, прерывает- ся вся цепочка превращений, ведущих к синтезу вещества Pn. При недостатке в клетке вещества Pn оно отсоединяется от аллостерического центра фермен- та E1 и все реакции ферментативной цепи возобновляются.

Рассмотренный механизм регуляции каталитической активности алло- стерических ферментов продуктами обмена веществ получил название инги- бирования по принципу обратной связи. Этот механизм включается и вы- ключается мгновенно и действует в течение нескольких минут или секунд. Однако при этом биосинтез ферментов, необходимых для получения вещест- ва Pn, не выключается, т. е. происходит неэкономное расходование клеточно- го материала.

 

3.5.2.   Контроль биосинтеза ферментов

Регуляция биосинтеза ферментов происходит на генетическом уровне путём регуляции процесса транскрипции генов, кодирующих структуру со- ответствующих ферментов, т. е. путём регуляции синтеза соответствующих мРНК.

 

Регуляторами биосинтеза ферментов выступают как соответствующие субстраты, так и конечные продукты цепей биохимических превращений. Накопление избытка субстрата вызывает усиление, или индукцию (лат. “in- ductio” — возбуждение), синтеза фермента, катализирующего превращение данного субстрата, а увеличение концентрации конечного продукта метабо- лической цепи приводит к подавлению, или репрессии (лат. “repressio” — подавление), синтеза всех ферментов, необходимых для образования данного продукта.

«Выключение» гена из процесса транскрипции происходит при его свя- зывании со специфическим регуляторным белком, а «включение» — при отсоединении регуляторного белка от гена. Регуляторные белки имеют алло- стерическую природу. При их связывании с субстратом или конечным про- дуктом метаболической цепи происходит изменение конформации регуля- торного белка. В результате в первом случае регуляторный белок отсоединя- ется от гена и происходит индукция биосинтеза соответствующего фермента, а во втором случае регуляторный белок связывается с геном и, наоборот,

«выключает» его из процесса транскрипции.

Механизм индукции и репрессии биосинтеза ферментов является более медленным, чем механизм аллостерической регуляции их каталитической ак- тивности. Он действует в течение многих минут или даже часов. Однако при этом обеспечивается экономный уровень обмена веществ.

 

3.5.3.   Другие механизмы регуляции ферментативной активности

Ещё одним способом регулирования каталитической активности фер- ментов является механизм конкурентного ингибирования конечным про- дуктом метаболической цепи. Примером такого рода регуляции фермента- тивной активности может служить ингибирование сукцинатдегидрогеназы щавелевоуксусной кислотой (ЩУК).

Фермент сукцинатдегидрогеназа (Е1) катализирует превращение янтар- ной кислоты в фумаровую. Последняя под воздействием фермента фумарат-

 

гидратазы (Е2) превращается в L-яблочную кислоту, из которой при участии фермента малатдегидрогеназы (Е3) образуется ЩУК:

СООН                   СООН                         СООН                      СООН

|                             |                                   |                                | СН2                 Е1          СН             Е2              СН2           Е3           СН2

|                            ||                                   |                               | СН2              – 2Н        СН          + Н2О    НО–СН         – 2Н          С=О

|                             |                                    |                               |

СООН                   СООН                          СООН                     СООН

Янтарная             Фумаровая                L-Яблочная           Щавелевоуксусная кислота                 кислота                     кислота                        кислота

 

Данная цепочка биохимических превращений является составной ча- стью цикла Кребса — узлового метаболического процесса, обеспечивающего взаимосвязь обмена углеводов, белков и липидов. Образование ЩУК являет- ся конечной стадией этого цикла.

Так как ЩУК по своему строению очень близка к янтарной кислоте — субстрату сукцинатдегидрогеназы, то она действует как конкурентный инги- битор данного фермента, связываясь с его активным центром вместо янтар- ной кислоты, и не допускает к нему субстрат. Поэтому при накоплении ЩУК происходит очень сильное ингибирование сукцинатдегидрогеназы, а следо- вательно, и остальных реакций цикла Кребса.

Особым механизмом регуляции ферментативной активности являются взаимодействия ферментов с ингибиторами белковой природы, изучению которых в последние годы уделяют огромное внимание. Такой ингибитор блокирует активный центр фермента за счёт белок-белковых взаимодейст- вий, в результате чего последний теряет свою каталитическую активность. Огромное значение имеет взаимодействие белковых ингибиторов с фермен- тами протеазами, катализирующими гидролиз полипептидных цепей, от ак- тивности которых в большой степени зависит интенсивность всего обмена веществ.

Существуют и другие механизмы регуляции ферментативной активно-

сти.

 

3.5.4.   Применение активаторов и ингибиторов ферментов

Итак, воздействие на ферменты различных активаторов и ингибиторов играет огромную роль в регулировании обмена веществ в клетке. Поэтому выяснение точного механизма стимулирования или ингибирования опреде- лённых ферментативных реакций очень важно для направленного примене- ния физиологически активных веществ в различных областях практической деятельности человека.

Активаторы и ингибиторы ферментов применяются в медицине в со- ставе лекарственных препаратов при заболеваниях, вызванных нарушениями обмена веществ. Так, например, при дефиците в питании физиологически важных микроэлементов их препараты используют для нормализации мета- болических процессов, включая механизмы активирования соответствующих ферментов. Ингибиторы ферментов применяются при заболеваниях, связан- ных с повышенной активностью тех или иных ферментов. Например, при ле- чении от диабета, ожирения, кариеса используют ингибиторы амилаз. Меха- низм действия многих антибиотиков и ядов (например, нервнопаралитиче- ских газов, используемых в военном деле) также связан с ингибированием активности ферментов.

Активаторы и ингибиторы ферментов используются и в сельском хо- зяйстве. Активаторы ферментов применяются, например, в качестве под- кормки для домашних животных, микроэлементов в составе микроудобрений и стимуляторов роста растений, а ингибиторы ферментов — в качестве пес- тицидов.

Ингибиторы ферментов часто применяются в научных исследованиях обменных процессов. Так, например, многие из промежуточных продуктов процесса брожения были открыты благодаря использованию ингибиторов ферментов: определённые ингибиторы блокировали последовательные ста- дии процесса брожения, в результате чего соответствующие промежуточные продукты накапливались в количествах, достаточных для их выделения и идентификации.

 

Ингибиторы используются также при изучении механизма действия ферментов. С их помощью выясняют субстратную специфичность ферментов и механизм их каталитической активности, а именно: природу химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса, хи- мическую природу активного центра фермента и состав образующих его функциональных групп.

 

3.6.   Химическое строение ферментов

По химическому строению все ферменты можно разделить на две группы: однокомпонентные (простые) и двухкомпонентные (сложные).

Однокомпонентные ферменты состоят целиком из белка и при пол- ном гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Однокомпо- нентными, например, являются ферменты, катализирующие различные реак- ции гидролиза — пепсин, трипсин, папаин, уреаза и др.

Приблизительно половина всех изученных ферментов являются двух- компонентными, т. е. состоят из двух частей: белка и небелковой части. Белковый компонент фермента называют апоферментом, а небелковый — коферментом.

Многие двухкомпонентные ферменты диссоциируют на апофермент и кофермент, и их легко можно разделить, например, диализом. Однако по от- дельности каждая из частей двухкомпонентного фермента не обладает ката- литической активностью, возникающей лишь при присоединении кофермен- та к апоферменту.

Химическая природа многих коферментов хорошо изучена. В их состав могут входить витамины, нуклеотиды, металлы. Важная роль витаминов в питании человека связана как раз с их участием в построении ферментов. По этой же причине многие микроэлементы являются обязательной составной частью пищевого рациона.

Двухкомпонентными ферментами являются пируватдекарбоксилаза, аминотрансферазы, алкогольдегидрогеназа, каталаза и многие другие.

 

В состав кофермента пируватдекарбоксилазы входит витамин B1, не- достаток которого в пище приводит к снижению каталитической активности этого фермента и торможению реакции декарбоксилирования пировиноград- ной кислоты:

пируватдекарбоксилаза                                О

CH3COCOOH                                               CO2   +   CH3–C

Н

Пировиноградная кислота                                             Уксусный альдегид

 

У ферментов аминотрансфераз коферментом является производное ви- тамина B6. Эти ферменты катализируют реакции переаминирования между аминокислотами и кетокислотами, например:

 

СООН

 

 

СООН

 

|

 

 

|

CH–NH2

|

 

CH3

|

C=O

|

 

CH3

|

CH2

|

+

C=O

|

CH2

|

+

CH–NH2

|

CH2

|

 

COOH

CH2

|

 

COOH

COOH

 

 

COOH

 

 

Глутаминовая

Пировиноградная

α-Кетоглутаровая

Аланин

кислота

кислота

кислота

 

 

В состав кофермента алкогольдегидрогеназы входят два нуклеотида, один из которых содержит витамин PP. Этот фермент катализирует реакцию окисления этилового спирта до уксусного альдегида:

 

алкогольдегидрогеназа                   О C2H5OH                                               CH3–C

– 2Н                                   Н

Этиловый спирт                                   Уксусный альдегид

 

Коферментом каталазы является сложное соединение, содержащее же- лезо. Она катализирует реакцию разложения пероксида водорода на воду и кислород:

 

каталаза

2О2                     2Н2О  +   О2

 

Коферменты играют роль активного центра двухкомпонентных фер- ментов, т. к. при образовании комплекса ES именно кофермент вступает во взаимодействие с субстратом.

Известно значительное число ферментов, которые имеют один и тот же кофермент; при этом они различаются по своей специфичности. Другими словами один и тот же кофермент может соединяться с разными апофермен- тами, образуя при этом разные ферменты. Следовательно, белковая часть ферментов определяет их субстратную специфичность.

Данное заключение является важным для понимания проблем специ- фичности ферментативного катализа.

 

 

3.7.   Номенклатура и классификация ферментов

Долгое время строго научной номенклатуры ферментов не существо- вало и наименования им давались различными способами.

Сначала ферменты получали свои названия по случайным признакам. Таковы, например, наименования пищеварительных ферментов — пепсина (греч. “πέψις” — пищеварение), трипсина (греч. “τρι̃ψις” — трение, разжи- жение) и др. Так постепенно исторически складывалась тривиальная (лат. “trivialis” — простой, обыденный) номенклатура ферментов.

Со временем, когда количество открытых ферментов возросло, про- должать давать им случайные названия стало неудобно. В 1883 г. француз- ский учёный-естествоиспытатель П. Э. Дюкло предложил образовывать на- именования ферментов от названий соответствующих субстратов, заменяя в них окончания на «-аза». Согласно этому правилу фермент, катализирующий реакцию гидролиза крахмала, стали называть амилазой (греч. “άμυλον” — крахмал), гидролиза жиров — липазой (греч. “λίπος” — жир), гидролиза мо- чевины — уреазой (лат. “urea” — мочевина), гидролиза протеинов — про-

 

теиназой, гидролиза целлюлозы — целлюлазой и т. д. Таким образом были заложены основы рациональной номенклатуры ферментов.

Затем в наименование фермента, помимо названия субстрата, стали также включать название типа катализируемой реакции. Например, фермент, катализирующий реакцию декарбоксилирования пировиноградной кислоты, был назван пируватдекарбоксилазой, а фермент, катализирующий реакцию отнятия атомов водорода от янтарной кислоты, — сукцинатдегидрогеназой (лат. “succinum” — янтарь).

 

3.7.1.   Общие принципы современной номенклатуры и классификации ферментов

Современные номенклатура и классификация ферментов были разра- ботаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе, состоявшемся в Москве в 1961 г.

В их основу была положена реакционная и субстратная специфичность ферментов, т. е. тип катализируемой химической реакции и природа субстра- та, т. к. именно они в совокупности представляют собой те специфические признаки, которые отличают один фермент от другого.

Были введены две номенклатуры ферментов: систематическая и триви- альная.

Систематическое наименование фермента является строго научным. Оно точно идентифицирует фермент, а также указывает его действие. Это наименование включает в себя название субстрата, тип катализируемой ре- акции и имеет окончание «-аза». Ни один фермент не может получить систе- матическое название, пока не будет установлено, какую именно химическую реакцию он катализирует.

К сожалению, систематические наименования ферментов нередко ока- зываются громоздкими и труднопроизносимыми. Например, систематиче- ское название фермента уреазы — мочевина–амидогидролаза, фермента ли-

 

пазы — триацилглицерол–ацилгидролаза, а фермента целлюлазы — 4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан 4-глюканогидролаза. Что же касается ферментов про- теиназ, то для них построить систематические названия оказалось и вовсе не- возможно. Поэтому при создании номенклатуры ферментов было разрешено наряду с систематическими использовать также их тривиальные названия.

Тривиальные наименования ферментов являются рабочими. Они достаточно краткие, т. к. ими должно быть удобно пользоваться в повседнев- ной практике, и не обязательно очень точные. В качестве тривиальной была сохранена большая часть номенклатуры, существовавшей на момент работы Комиссии по ферментам. Тривиальные названия новых ферментов обычно представляют собой сокращённые варианты их систематических наименова- ний.

Из систематических и тривиальных наименований всех открытых фер- ментов был составлен «Список ферментов». Первоначально он содержал на- звания около 900 ферментов, в настоящее время этот список включает на- именования уже более 4200 ферментов и перечень их непрерывно пополня- ется.

В «Списке…» ферменты располагаются в соответствии с системой их классификации, разработанной Комиссией по ферментам. Эта система пре- дусматривает разделение ферментов на 6 классов, за каждым из которых за- креплён свой порядковый номер. В свою очередь классы подразделяются на подклассы, каждый из которых также имеет свой порядковый номер в пре- делах класса. Далее в подклассах формируются более мелкие группы фер- ментов — подподклассы, которые тоже обладают своими порядковыми но- мерами в пределах подкласса. Наконец, в каждом подподклассе ферменты располагаются в определённой последовательности, где им также присваи- ваются порядковые номера. Последовательность расположения ферментов в подподклассе определяется последовательностью их открытия: новые фер- менты по мере открытия помещают в конец соответствующего подподкласса.

 

Таким образом, за каждым ферментом в классификации закреплено своё постоянное место, которое определяется его индивидуальным шифром, или кодом. Шифр любого фермента состоит из четырёх чисел, разделённых точками. Первое число шифра указывает номер класса, второе — номер под- класса, третье — номер подподкласса и четвёртое — порядковый номер фермента в подподклассе. Так, например, фермент трипсин имеет шифр

3.4.21.4. Первое число этого шифра (3) показывает, что данный фермент от- носится к третьему классу и, как и все представители данного класса фер- ментов, катализирует реакции гидролиза. Второе число данного шифра (4) указывает на то, что трипсин в своём классе принадлежит к четвёртому под- классу ферментов, т. е. катализирует реакции гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Третье число шифра трипсина (21) означает, что данный фермент принадлежит к подподклассу ферментов, в построении активного центра которых принимает участие аминокислота серин. Наконец, последнее число шифра трипсина (4) указывает на то, что в своём подподклассе он име- ет четвёртый порядковый номер.

Согласно международной классификации выделяют следующие шесть классов ферментов:

  1. Оксидоредуктазы. К этому классу принадлежат все ферменты, ка- тализирующие окислительно-восстановительные реакции.
  2. Трансферазы. Ферменты этого класса катализируют реакции пере- носа той или иной химической группы от одного соединения (донора груп- пы) к другому соединению (акцептору этой группы).
  3. Гидролазы. Эти ферменты катализируют реакции гидролитического расщепления различных химических связей: сложноэфирных, гликозидных, пептидных и иных.
  4. Лиазы. Ферменты этого класса катализируют реакции негидролити- ческого расщепления различных химических связей, сопровождающиеся об- разованием двойной связи, или, наоборот, реакции присоединения опреде- лённой химической группы к двойной связи.

 

  1. Изомеразы. Эти ферменты катализируют геометрические или струк- турные изменения в пределах одной молекулы.
  2. Лигазы (синтетазы). К этому классу принадлежат ферменты, ката- лизирующие реакции соединения друг с другом двух молекул, сопряжённые с гидролизом высокоэнергетической связи в молекуле АТФ или другого нук- леозидтрифосфата. Следовательно, на реакции, катализируемые ферментами данного класса, клетка затрачивает энергию, аккумулированную в АТФ или других НТФ.

Рассматривая далее каталитическое действие важнейших представите- лей отдельных классов ферментов, можно убедиться в том, что большинство ферментов обладает ярко выраженной специфичностью, т. е. действует толь- ко на один субстрат или на определённые химические связи в различных субстратах.

 

3.7.2.   Класс 1. Оксидоредуктазы

Оксидоредуктазы — это ферменты, катализирующие окислительно- восстановительные реакции, происходящие в клетке. Окисление веществ в организме может осуществляться тремя разными путями: отнятием водорода либо электронов и присоединением кислорода.

Окисление путём отнятия водорода. Это наиболее распространённый тип биологического окисления, представляющий собой реакцию дегидриро- вания окисляемого субстрата:

АН2   +   В              А   +   ВН2

 

В данной реакции АН2 представляет собой восстановленное вещество, служащее донором водорода, а В — окисленное вещество, которое служит акцептором водорода. В ходе реакции вещество АН2 окисляется до А, а ве- щество В восстанавливается до ВН2.

Акцепторами водорода в реакциях данного типа могут быть различные вещества, в том числе и кислород воздуха.

 

Ферменты, катализирующие реакции дегидрирования, в которых ак- цептором водорода не является кислород, называют дегидрогеназами.

По химическому строению все дегидрогеназы являются двухкомпо- нентными ферментами, т. е. их молекулы состоят из апофермента и кофер- мента. В качестве коферментов они содержат сложные соединения двух ти- пов.

К первому типу коферментов дегидрогеназ относятся два вещества — никотинамидадениндинуклеотид (сокращённо НАД+) и никотинамидаденин- динуклеотидфосфат (сокращённо НАДФ+). Они имеют следующий химиче- ский состав:

 

НАД+:     аденин – рибоза – è – è – рибоза – никотинамид+

 

НАДФ+:  аденин – рибозо-2-фосфат – è – è – рибоза – никотинамид+

 

Входящий в состав коферментов НАД+ и НАДФ+ никотинамид являет- ся витамином РР.

Ко второму типу коферментов дегидрогеназ относятся тоже два веще- ства — флавинадениндинуклеотид (сокращённо ФАД) и флавинмононуклео- тид (сокращённо ФМН). Их химический состав следующий:

 

ФАД: флавин – рибитол – è – è – рибоза – аденин ФМН: флавин – рибитол – è

Входящий в состав коферментов ФАД и ФМН фрагмент «флавин – ри- битол» представляет собой витамин В2 (рибофлавин).

Коферменты НАД+, НАДФ+, ФАД или ФМН, соединяясь в клетке с тем или иным специфическим белком, образуют разные дегидрогеназы. Так, на- пример, кофермент НАД+ входит в состав ферментов алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, а кофермент ФАД — в состав фермента сукцинатде- гидрогеназы. Соответствующие названия дегидрогеназы получают в зависи- мости от химической природы окисляемого субстрата.

 

Фермент алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1) катализирует реакцию окисления этилового спирта до уксусного альдегида:

 

алкогольдегидрогеназа                  О

С2Н5ОН  +   НАД+                                              СН3–С        +   НАД·Н  +   Н+ Н

Этиловый                                                    Уксусный альдегид

спирт

 

Фермент лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) катализирует реакцию окисления молочной кислоты до пировиноградной:

лактатдегидрогеназа

СН3-СН-СООН + НАД+                                     СН3-СО-СООН + НАД·Н + Н+

|

ОН                                                           Пировиноградная

Молочная кислота                                                   кислота

 

Алкогольдегидрогеназа участвует в процессе спиртового брожения, а лактатдегидрогеназа — в процессе молочнокислого брожения.

Различное действие алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы яс- но показывает, что специфичность двухкомпонентных ферментов обуслов- лена белковой природой апофермента, с которым связан кофермент.

Фермент сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) катализирует реакцию окисления янтарной кислоты до фумаровой:

 

СН2–СООН                   сукцинатдегидрогеназа     СН–СООН

|                     + ФАД                                                 ||                 + ФАД·Н2

СН2–СООН                                                              СН–СООН

Янтарная кислота                                                  Фумаровая кислота

 

Сукцинатдегидрогеназа принимает участие в процессе дыхания. Ферменты, катализирующие реакции дегидрирования, в которых ак-

цептором водорода является кислород, называют оксидазами.

В результате реакций дегидрирования, катализируемых оксидазами, образуется перекись водорода или вода:

 

АН2   +   О2              А   +   Н2О2

 

2АН2  +   О2              2А   +   2Н2О

 

Чаще всего коферментами оксидаз являются ФАД или ФМН. Напри- мер, в состав фермента глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4) входит ФАД.

Глюкозооксидаза катализирует реакцию окисления β-D-глюкозы с об- разованием D-глюконовой кислоты и пероксида водорода:

 

глюкозооксидаза

β-D-Глюкоза  +   О2                                   D-Глюконовая кислота  +   Н2О2

+ H2O

Данная реакция протекает в несколько этапов. На первой стадии про- исходит отнятие двух атомов водорода от молекулы β-D-глюкозы с образова- нием ФАД·Н2 и лактона D-глюконовой кислоты. Далее ФАД·Н2 реагирует с кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, а лактон D-глюконо- вой кислоты взаимодействует с водой, в результате чего образуется D-глюко- новая кислота.

Коферментами оксидаз также могут быть и некоторые металлы. Так, например, в состав фермента аскорбатоксидазы (КФ 1.10.3.3), катализирую- щей реакцию окисления L-аскорбиновой кислоты до L-дегидроаскорбиновой кислоты, входят ионы меди:

 

аскорбатоксидаза

2 L-Аскорбиновая кислота +   О2

 

2 L-Дегидроаскорбиновая кислота +   2Н2О

 

Оксидазами называют также ферменты, катализирующие реакции, в которых кислород воздуха является непосредственным акцептором электро- нов.

Окисление путём отнятия электронов. Наиболее распространёнными реакциями данного типа являются реакции окисления атомов водорода, сня- тых с субстрата.

 

Отнятие электронов от атомов водорода осуществляют специальные белки — цитохромы (греч. “κύτος” — клетка + “χρῶμα” — окраска). Они представляют собой хромопротеиды, простетической группой которых явля- ется гем — порфириновый цикл, содержащий в центре молекулы ион желе- за.

Способность цитохромов окислять атомы водорода обусловлена тем, что ион железа в геме может обратимо изменять свою валентность:

 

+ ē

Fe3+                    Fe2+

– ē

 

В результате взаимодействия атома водорода с ионом окисленного же- леза цитохрома образуется ион водорода:

 

Н   +   Цитохром (Fe3+)              Н+   +   Цитохром (Fe2+)

 

Цитохромы объединяются в цепи, в которых отнятые от атомов водо- рода электроны последовательно передаются от одного цитохрома к другому. Конечным акцептором электронов в этих цепочках является кислород возду- ха. Реакцию передачи электронов от последнего цитохрома в цепи на кисло- род катализирует фермент цитохромоксидаза (КФ 1.9.3.1):

 

цитохромоксидаза

1/2 О2  +   2 Цитохром (Fe2+)                                   О2–   +   2 Цитохром (Fe3+)

 

В состав цитохромоксидазы входит два гема и два иона меди.

Возникающий в результате данной реакции анион О2– взаимодействует с двумя ионами водорода с образованием воды:

 

О2–   +   2Н+              Н2О

Как известно, окисление веществ всегда сопровождается выделением энергии. В ходе реакции образования воды (Н2 + 1/2 О2 Н2О) высвобож-

 

дается 239 кДж/моль тепла. Выделение такого количества теплоты вызывает быстрое расширение образующихся паров воды, и поэтому данная реакция протекает с взрывом. Понятно, что в живой клетке в таком виде эта реакция протекать не может, так как это было бы губительно для клетки.

Поэтому окислительно-восстановительные процессы в клетке очень часто представляют собой цепи реакций, в ходе которых водород или элек- троны передаются поэтапно от одного промежуточного переносчика к дру- гому. Такой многоступенчатый путь окисления веществ позволяет клетке по- лучать выделяющуюся энергию небольшими порциями и аккумулировать её в молекулах аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ).

В общем виде такой многоступенчатый путь окислительно-восстанови- тельного процесса выглядит следующим образом:

 

АН2 (субстрат                    ФАД                 2Fe2+ (цитохромы            1/2 О2 восстановленный)                                      восстановленные)

 

 

 

А (субстрат                                           2Fe3+ (цитохромы окисленный)                                   ФАД·Н2                 окисленные)                  О2–

+            Н2О

 

Окисление путём присоединения кислорода. Это совершенно иной путь биологического окисления. Ферменты, катализирующие реакции при- соединения атома или молекулы кислорода к субстрату, называют оксигена- зами.

К этой группе оксидоредуктаз принадлежит фермент липоксигеназа (КФ 1.13.11.12). Она катализирует реакции окисления полиненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот (линолевой, линоленовой) кислородом воздуха с образованием высокотоксичных гидропероксидов или пероксидов, например:

 

R1– CH = CH – CH2 – CH = СН –R2

Жирная кислота липоксигеназа    +   О2

R1– CH – CH = CH – CH = СН –R2

|

O – OH

Гидропероксид жирной кислоты

 

Липоксигеназа участвует в процессе прогоркания жиров.

Каталаза и пероксидаза. В некоторых окислительно-восстановитель- ных реакциях (например, в реакции, катализируемой глюкозооксидазой) об- разуется пероксид водорода, который в больших концентрациях вреден для организма. Реакции обезвреживания Н2О2 в клетках катализируют ферменты каталаза (КФ 1.11.1.6) и пероксидаза (КФ 1.11.1.7):

каталаза

2О2                    2Н2О  +   О2

 

пероксидаза

АН2   +   Н2О2                          А   +   2Н2О

Донор                              Окисленный

водорода                                 донор

 

Каталаза и пероксидаза — двухкомпонентные ферменты, содержащие  в качестве кофермента гем. Следовательно, различия в каталитической функ- ции этих ферментов объясняются различиями в строении их апоферментов. Это подтверждает, что именно белковая природа апофермента определяет специфичность двухкомпонентных ферментов.

 

3.7.3.   Класс 2. Трансферазы

Трансферазы — это ферменты, катализирующие реакции переноса химических группировок от одного соединения к другому. В зависимости от химической природы и строения переносимых групп ферменты этого класса подразделяют на более мелкие классификационные единицы, среди которых

 

наиболее важными являются фосфотрансферазы, аминотрансферазы, глико- зилтрансферазы и ацилтрансферазы.

Фосфотрансферазы (КФ 2.7.1–4, 9–13, 99) катализируют реакции пе- реноса остатка фосфорной кислоты (–РО3Н2), в большинстве случаев от мо- лекулы АТФ.

Например, фермент гексокиназа (КФ 2.7.1.1) катализирует реакцию пе- реноса остатка фосфорной кислоты от АТФ на D-глюкозу с образованием D- глюкозо-6-фосфата и АДФ:

 

гексокиназа

D-Глюкоза  +   АТФ                              D-Глюкозо-6-фосфат  +   АДФ

 

В результате этой реакции образуется активированная молекула глюко- зы. Фермент гексокиназа принимает участие в процессах брожения и дыха- ния.

Аминотрансферазы (КФ 2.6.1) катализируют реакции переаминиро- вания между аминокислотами и кетокислотами:

 

 

Н2N–CH–COOH

|

+

O=C–COOH

|

O=C–COOH  +

|

Н2N–CH–COOH

|

R1

Аминокислота I

 

R2

Кетокислота II

R1

Кетокислота I

R2

Аминокислота II

 

Эти ферменты играют решающую роль в биосинтезе аминокислот. Од- на из ключевых реакций, катализируемых аминотрансферазами, — перенос аминной группы от L-глутаминовой кислоты к пировиноградной кислоте под воздействием фермента аланинаминотрансферазы (КФ 2.6.1.2) — представ- лена на с. 213.

Аминотрансферазы являются двухкомпонентными ферментами, ко- ферментом им служит производное витамина В6.

Гликозилтрансферазы (КФ 2.4) катализируют реакции переноса ос- татков моносахаридов (например, глюкозы) с одного соединения на другое.

 

Ферменты этого подкласса участвуют в процессах биосинтеза полисахари- дов.

Например, фермент сахарозосинтаза (КФ 2.4.1.13) участвует в процессе биосинтеза растениями дисахарида сахарозы, катализируя реакцию переноса остатка D-глюкозы с УДФ-глюкозы на D-фруктозу:

сахарозосинтаза

УДФ-глюкоза  +   D-Фруктоза                                 УДФ   +   Сахароза

 

Ацилтрансферазы (КФ 2.3) катализируют реакции переноса остатков жирных кислот (ацилов). Ферменты этого подкласса являются двухкомпо- нентными, в их состав входит кофермент А (HS–КоА) — сложное соедине- ние, содержащее витамин В3.

О         О

 

тиолаза               О

О

СН3-С-СН2-С~S-КоА  +

HS-КоА

СН3-С~S-КоА

+   СН3-С~S-КоА

 

 

Чаще всего переносу подвергается ацил уксусной кислоты — ацетил (СН3–СО–). Например, фермент тиолаза (КФ 2.3.1.9) катализирует реакцию отщепления ацетильного остатка в процессе распада жирных кислот:

               
               

Ацетоацетил-КоА             КоА                     Ацетил-КоА         Ацетил-КоА Ацилтрансферазы участвуют не только в распаде жирных кислот, но

также играют важную роль в биосинтезе жирных кислот, жиров, фосфатидов и других процессах.

 

3.7.4.   Класс 3. Гидролазы

Гидролазы — это ферменты, катализирующие реакции гидролиза, за- ключающиеся в расщеплении сложных органических соединений с присое- динением молекулы воды по месту расщепляемой связи. К этому классу от- носятся многие ферменты, имеющие промышленное значение, а также боль- шинство пищеварительных ферментов.

Тривиальные  наименования  ферментов  данного  класса  имеют   одну

особенность: в большинстве случаев они образуются непосредственно от  на-

 

звания гидролизуемого субстрата путём замены его окончания на «-аза», при этом название типа катализируемой реакции в состав тривиального наимено- вания ферментов гидролаз не включается.

Гидролазы подразделяют на подклассы в зависимости от химической природы расщепляемой связи. Среди них наибольшее значение имеют три подкласса — эстеразы, гликозидазы и протеазы.

Эстеразы (КФ 3.1) образуют подкласс ферментов, катализирующих реакции гидролиза сложных эфиров в соответствии с уравнением:

О                        эстераза                О

R1 – C – O – R2  +   H2O                  R1 – C – OH  +   R2 – OH

 

сложноэфирная связь, расщепляемая эстеразами

 

Среди эстераз наибольшее практическое значение имеют два фермента

— липаза и пектинэстераза.

Липаза (КФ 3.1.1.3) катализирует гидролитический распад жиров:

 

 

O

H2C–O–C–R1

 

 

 

 

H2C–OH

 

 

R1 – COOH

|            O

 

 

липаза

|

 

 

HC–O–C–R2

|            O

+

3H2O

 

HC–OH

|

+

R2 – COOH

Н2С–О–С–R3

 

 

 

Н2С–ОН

 

R3 – СООН

Жир

 

 

 

Глицерин

 

Жирные кислоты

 

Действие липазы имеет большое значение при переработке и хранении пищевого сырья и продуктов, особенно — богатых жирами.

Пектинэстераза (КФ 3.1.1.11) катализирует гидролитическое расщеп- ление растворимого пектина.

Гликозидазы (КФ 3.2.) катализируют реакции гидролитического рас- щепления гликозидных связей в олиго- и полисахаридах и гликозидах.

К числу важнейших представителей ферментов этого подкласса при- надлежит β-фруктофуранозидаза (инвертаза, или сахараза) (КФ 3.2.1.26), ка- тализирующая гидролиз сахарозы и рафинозы. Так, в результате воздействия

 

этого фермента на сахарозу образуется смесь эквимолярных количеств α-D- глюкозы и β-D-фруктозы, получившая название «инвертный сахар»:

 

СН2ОН

СН2ОН                                                 О                            И

О                                  Н  Н             Н                       н Н Н                    Н                                                                          в

НО  ОН     Н  ОН                    е

НО  ОН     Н                                                                               р

Н         ОН                       т

Н      НО            + Н2О              α-D-Глюкоза                     н О                                           +                               ы

НОСН2   О                                   НОСН2    О        ОН                  й

с

Н  Н     НО                                  Н Н     НО                          а СН2ОН                                         СН2ОН           х

ОН     Н                                       ОН      Н                         а

р

Сахароза                                 β-D-Фруктоза

действие β-фруктофуранозидазы

 

Большое практическое значение среди гликозидаз имеют также фер- менты амилазы (КФ 3.2.1.1–3), катализирующие расщепление крахмала и гликогена, ферменты целлюлазы (КФ 3.2.1.4, КФ 3.2.1.74), ускоряющие рас- щепление клетчатки, фермент β-галактозидаза (КФ 3.2.1.23), катализирую- щий гидролиз лактозы, и некоторые другие.

Протеазы (пептид-гидролазы, протеолитические ферменты) (КФ 3.4) представляют собой большую группу ферментов, катализирующих реак- ции гидролитического расщепления пептидных связей в белках и пептидах в соответствии с уравнением:

O                                                        O

||                               протеаза            ||

R1 – C – N – R2 +   Н2O                    R1 – C – OH  +   H – N – R2

|                                                                              |

H                                                                            H

пептидная связь, расщепляемая протеазами

 

Процесс гидролиза белков и пептидов, катализируемый ферментами данного подкласса, называют протеолизом. Поэтому, согласно систематиче- ской номенклатуре ферментов, протеазы называют пептид-гидролазами, а также протеолитическими ферментами.

Классификация пептид-гидролаз затруднена, так как эти ферменты об- ладают относительной субстратной специфичностью. Избирательность дей- ствия протеолитических ферментов определяется совокупностью факторов:

  • 1) местоположением гидролизуемой пептидной связи в полипептидной цепи;
  • 2) химической природой радикала аминокислоты, участвующей в образова- нии пептидной связи, гидролиз которой катализирует фермент; 3) химиче- ской природой радикалов аминокислот, удалённых от гидролизуемой пеп- тидной связи; 4) общей пространственной конформацией молекулы белка, делающей определённые пептидные связи доступными для воздействия фер- мента. Таким образом, классификация пептид-гидролаз основана на ряде раз- личных критериев.

Согласно классификации пептид-гидролазы подразделяют на протеи- назы и пептидазы. Протеиназы могут катализировать гидролиз непосредст- венно белков, воздействуя на глубинные пептидные связи, в результате чего белковая молекула распадается до пептидов. Пептидазы катализируют гид- ролитическое расщепление пептидов, воздействуя на наружные пептидные связи в субстрате, в результате чего образуется смесь свободных аминокис- лот.

Таким образом, гидролиз белков в организме при участии протеолити- ческих ферментов протекает в два этапа. Вначале молекула белка атакуется протеиназами по глубинным пептидным связям, в результате чего образуют- ся пептиды, а затем последние расщепляются пептидазами до аминокислот:

 

протеиназы                    пептидазы

Белок                          Пептиды                       Аминокислоты

 

Вышеописанные различия между протеиназами и пептидазами свиде- тельствуют об избирательном действии пептид-гидролаз.

Протеиназы (КФ 3.4.21–25, 99) разделены на несколько подподклас- сов на основании различий в механизме катализа, обусловленных особенно- стями строения их активных центров. Важнейшими подподклассами протеи- наз являются сериновые, тиоловые, кислые протеиназы и металлопротеина- зы.

Сериновые протеиназы (КФ 3.4.21) содержат в активном центре ОН-группу остатка аминокислоты серина и имидазольную группу остатка аминокислоты гистидина. Типичным представителем сериновых протеиназ является фермент трипсин (КФ 3.4.21.4).

Трипсин содержится в соке, выделяемом поджелудочной железой, и действует в двенадцатиперстной кишке. Оптимальная зона рН для действия трипсина — 7,5–9,0. Этот фермент обладает высокой специфичностью дей- ствия, он катализирует гидролиз в белках только таких пептидных связей, в образовании которых участвуют остатки карбоксильных групп лизина или аргинина:

 

  • ·· –NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO– ···

|                     |                     |                     |

Rx                              Rx + 1                       Rx + 2                       Rx + 3

(лиз; арг)

место действия трипсина

 

В пищеварительном соке поджелудочной железы трипсин содержится в неактивной форме в виде трипсиногена, который в кишечнике превраща- ется в активный фермент трипсин путём отщепления короткого пептида от N-конца трипсиногена под воздействием фермента энтерокиназы (энтеропеп- тидазы) (КФ 3.4.21.9). Так, например, происходит активация бычьего трип- синогена:

 

энтерокиназа

Трипсиноген                                         Трипсин          +          Гексапептид (229 аминокислот-                                    (223 аминокислот-

ных остатков)                                    ных остатка)

 

Отщепление N-концевого пептида от трипсиногена вызывает конфор- мационные изменения в оставшейся части белковой молекулы, обуславли- вающие формирование активного центра трипсина.

Тиоловые (цистеиновые) протеиназы (КФ 3.4.22) содержат в актив- ном центре SН-группу остатка аминокислоты цистеина. Типичным предста- вителем данной группы протеолитических ферментов является папаин (КФ 3.4.22.2).

Папаин был выделен из плодов тропического растения Carica papaya (дынное дерево). Область оптимальных значений рН для его действия колеб- лется в зависимости от природы гидролизуемого белка в интервале от 5,0 до 7,5. По сравнению с трипсином папаин обладает менее выраженной избира- тельностью действия в отношении гидролизуемых пептидных связей. Пре- имущественно он катализирует гидролиз в субстратах второй пептидной свя- зи, лежащей за остатком карбоксильной группы фенилаланина:

 

  • ·· –NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO– ···

|                     |                     |                     |

Ry                             Ry + 1                       Ry + 2                       Ry + 3

(фен)

место действия папаина

 

Все тиоловые ферменты активируются веществами, обладающими свойствами восстановителей — цистеином, восстановленным глутатионом и т. п. Например, активирование папаина восстановленным глутатионом про- исходит следующим образом:

 

Па–S–S–Г

+

Г–SН

Па–SН

+

Г–S–S–Г

Папаин–глутатион

 

Восстановлен-

Папаин

 

Окисленный

(неактивная форма)       ный глутатион        (активная форма)      глутатион

 

Таким образом, каталитически активной является восстановленная форма папаина, а окисление сульфгидрильной группы (–SH) в активном цен- тре фермента приводит к исчезновению его активности.

Кислые (карбоксильные, аспартильные) протеиназы (КФ 3.4.23) содержат в активном центре СООН-группы двух остатков аспарагиновой ки- слоты, вследствие чего величина оптимальных значений рН для их действия не превышает 5. Типичным представителем ферментов данного подподклас- са является пепсин (КФ 3.4.23.1).

Пепсин вырабатывается слизистой оболочкой желудка и действует в полости желудка в сильнокислой среде. Оптимальная зона рН для его дейст- вия находится в интервале от 1,5 до 2,0. Пепсин обладает широкой субстрат- ной специфичностью. Преимущественно он катализирует расщепление в белках тех пептидных связей, которые образованы при участии остатков аминных групп ароматических аминокислот — фенилаланина или тирозина:

  • ·· –NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–CO– ···

|                     |                     |                     |

Rz                              Rz + 1                        Rz + 2                        Rz + 3

(фен; тир) место действия пепсина

Желудочный сок имеет величину рН от 1,5 до 2,5. В условиях таких значений рН глобулярные белки подвергаются денатурации, их молекулы разворачиваются и вследствие этого внутренние пептидные связи полипеп- тидных цепей становятся более доступными для ферментативного гидролиза пепсином.

В клетках слизистой оболочки желудка пепсин синтезируется в неак- тивной форме в виде пепсиногена, который в полости желудка превращается в активный пепсин в результате отщепления от него N-концевой части моле- кулы, включающей около 40 аминокислотных остатков. Отщепление данной части пепсиногена, которая служит своеобразным экраном, прикрывающим активный центр пепсина, приводит к тому, что из оставшейся части молеку-

 

лы пепсиногена образуется каталитически активный фермент. Превращение пепсиногена в пепсин вначале происходит под воздействием соляной кисло- ты, содержащейся в желудочном соке, а затем и самого пепсина. Так, напри- мер, происходит активация свиного пепсиногена:

HCl, пепсин

Пепсиноген                                           Пепсин    +    Смесь пептидов  (363 аминокислот-                                  (321 аминокислот- (42 аминокислот-

ных остатка)                                    ный остаток)                 ных остатка)

 

Существование неактивных форм ряда ферментов, называемых зимо- генами (трипсиноген, пепсиноген), — это защитный механизм, созданный природой для предотвращения нежелательного воздействия ферментов на ткани самого организма (поджелудочной железы, желудка).

Механизм активации ферментов путём избирательного гидролиза оп- ределённых пептидных связей в их зимогенах носит название активации пу- тём ограниченного протеолиза. Этот механизм имеет первостепенное зна- чение для регуляции обмена веществ в организме. Его преимуществами яв- ляются быстрота и высокая экономичность, так как в результате гидролиза всего одной или нескольких пептидных связей, что не требует больших энер- гетических затрат, из зимогена легко образуется каталитически активный фермент.

Таким образом, участие в полном гидролизе белков в организме не яв- ляется единственной функцией протеиназ. Не менее важной функцией этих ферментов является их участие в процессе регуляции обмена веществ путём активации многих ферментов с помощью механизма ограниченного протео- лиза.

Металлопротеиназы (КФ 3.4.24) образуют группу протеиназ, которые содержат в активном центре ионы металлов (Zn2+, Ca2+), необходимые для проявления их каталитической способности.

Пептидазы (КФ 3.4.11, 13–19), также как и протеиназы, разделены на несколько подподклассов. В основу классификации пептидаз положена изби-

 

рательность их действия, которая определяется местоположением гидроли- зуемой пептидной связи в субстрате. Важнейшими подподклассами пептидаз являются аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.

Аминопептидазы (КФ 3.4.11) — ферменты, для действия которых не- обходимо наличие вблизи гидролизуемой пептидной связи свободной амин- ной группы. Следовательно, аминопептидазы катализируют последователь- ное отщепление свободных аминокислот от N-конца полипептидной цепоч- ки:

Н2N-CH-CO–NH-CH-CO-··· + Н2O          Н2N-CH-COОН + H2N-CH-CO-···

|                    |                                              |                            |

R1                            R2                                                                        R1                                          R2

место действия аминопептидазы

Таким образом, аминопептидазы катализируют отщепление от суб- страта N-концевых аминокислот.

Карбоксипептидазы (КФ 3.4.16–19) — ферменты, катализирующие гидролиз в субстрате пептидной связи, находящейся вблизи свободной кар- боксильной группы. При этом последовательно отщепляются свободные аминокислоты от С-конца полипептидной цепочки:

  • ··-NH-CH-CO-NH-CH-COОН + Н2O ···-NH-CH-COОН + H2N-CH-COОН

|                   |                                              |                            |

Rn – 1                     Rn                                                                        Rn – 1                                    Rn место действия карбоксипептидазы

Таким образом, карбоксипептидазы катализируют отщепление от суб- страта С-концевых аминокислот.

Дипептидазы (КФ 3.4.13) — ферменты, катализирующие гидролиз в субстрате пептидной связи, находящейся одновременно вблизи как свобод- ной аминной, так и свободной карбоксильной группы:

Н2N-CH-CO–NH-CH-COОН + Н2O        Н2N-CH-COОН + H2N-CH-COОН

|                   |                                             |                            |

R1                           R2                                                                       R1                                          R2

место действия дипептидазы

 

Таким образом, дипептидазы катализируют гидролитическое расщеп- ление дипептидов на свободные аминокислоты.

 

3.7.5.   Класс 4. Лиазы

Лиазы — это ферменты, катализирующие отщепление от субстратов негидролитическим путём какой-либо химической группы с образованием двойной связи (или присоединение группы к двойной связи). Наиболее важ- ными ферментами данного класса являются пируватдекарбоксилаза, альдола- за, енолаза и некоторые другие.

Пируватдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.1) катализирует отщепление угле- кислого газа от молекулы пировиноградной кислоты:

 

пируватдекарбоксилаза                                  О

CH3COCOOH                                               CO2   +   CH3–C

Н

Пировиноградная кислота                                            Уксусный альдегид

 

Эта реакция является ключевой реакцией углеводного обмена.

Пируватдекарбоксилаза — двухкомпонентный фермент, в состав её кофермента входит витамин В1.

Альдолаза (КФ 4.1.2.13) катализирует обратимую реакцию негидроли- тического расщепления D-фруктозо-1,6-бисфосфата в соответствии с уравне- нием:

 

èОСН2   О        СН2Оè                             СН2Оè                    СН2Оè

альдолаза          |                                |

(α)                                    СНОН          +          С=О Н  Н           НО  ОН                                      |     О                         |

С                               СН2ОН

ОН     Н                                                   Н

D-Фруктозо-1,6-бисфосфат                  3-Фосфоглицери-         Фосфодигид-

новый альдегид          роксиацетон

 

Альдолаза участвует в процессах фотосинтеза и диссимиляции (броже- ния и дыхания).

 

Енолаза (КФ 4.2.1.11) также участвует в процессах брожения и дыха- ния, катализируя реакцию отщепления воды от 2-фосфоглицериновой кисло- ты с образованием 2-фосфоенолпировиноградной кислоты в соответствии с уравнением:

 

СН2ОН

|

 

енолаза

СН2

||

НС–О–è

 

C~O–è

| СООН

– Н2О

| СООН

2-Фосфоглицери-

 

2-Фосфоенолпиро-

новая кислота

 

виноградная кислота

 

Образующаяся в результате этой реакции 2-фосфоенолпировиноград- ная кислота представляет собой высокоэнергетическое фосфорилированное соединение, которое играет важную роль в процессе ферментативного запа- сания метаболической энергии с образованием молекулы АТФ.

К числу других важных ферментов класса лиаз принадлежат: рибулозо- 1,5-бисфосфат–карбоксилаза (КФ 4.1.1.39), играющая ключевую роль в про- цессе фотосинтеза; фумарат-гидратаза (КФ 4.2.1.2), участвующая в процессе дыхания (реакция, ускоряемая этим ферментом, представлена на с. 210); ас- партат–аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.1), катализирующая взаимное превращение фумаровой и L-аспарагиновой кислот в соответствии с уравнением:

 

СН–СООН                    аспартат–аммиак-лиаза    Н2N–CH–COOH

||                    +   NH3                                                          |

СН–СООН                                                                        СН2–СООН

Фумаровая кислота                                                   L-Аспарагиновая кислота

 

 

3.7.6.   Класс 5. Изомеразы

Изомеразы — это ферменты, катализирующие изомеризацию различ- ных органических соединений. Среди ферментов этого класса важнейшее значение имеют триозофосфатизомераза, глюкозо-6-фосфат–изомераза и фосфоглицерат-фосфомутаза.

 

Триозофосфатизомераза (КФ 5.3.1.1) катализирует взаимопревраще- ния 3-фосфоглицеринового альдегида и фосфодигидроксиацетона:

 

СН2Оè                                                       СН2Оè

|                   триозофосфатизомераза        | СНОН                                                                    С=О

|     О                                                            |

С                                                                  СН2ОН

Н

3-Фосфоглицериновый альдегид                          Фосфодигидроксиацетон

 

Глюкозо-6-фосфат–изомераза (КФ 5.3.1.9) ускоряет взаимные пре- вращения D-глюкозо-6-фосфата и D-фруктозо-6-фосфата:

 

СН2Оè

О                                                               èОСН2   О        СН2ОН

Н  Н             Н       глюкозо-6-фосфат–изомераза

(α)                                                                                    (α)

НО  ОН     Н  ОН                                                             Н  Н     НО   ОН

 

Н         ОН                                                                        ОН      Н

D-Глюкозо-6-фосфат                                                      D-Фруктозо-6-фосфат

 

Фосфоглицерат-фосфомутаза (КФ 5.4.2.1) катализирует изомериза- цию 3-фосфоглицериновой кислоты в 2-фосфоглицериновую:

 

СН2О–è

 

СН2ОН

|

НСОН

фосфоглицерат-фосфомутаза

|

НС–О–è

| СООН

 

| СООН

 

  • 3- Фосфоглицериновая кислота 2-Фосфоглицериновая кислота

 

Эти три фермента имеют громадное значение для углеводного обмена и прежде всего для процессов диссимиляции (брожения и дыхания), а трио- зофосфатизомераза необходима также для процесса фотосинтеза.

 

3.7.7.   Класс 6. Лигазы (синтетазы)

Лигазы (синтетазы) — это ферменты, катализирующие соединение двух молекул, сопровождающееся расщеплением высокоэнергетической свя- зи в молекуле АТФ или другого НТФ. При отщеплении от НТФ одного или двух остатков фосфорной кислоты выделяется энергия, которая, как извест- но, всегда требуется для протекания реакций синтеза веществ. Характерными представителями лигаз являются амид-синтетазы, ацил-КоА–синтетазы и аминоацил-тРНК–синтетазы.

Амид-синтетазы (КФ 6.3.1) ускоряют синтез амидов. Так, например, фермент глутаминсинтетаза (КФ 6.3.1.2) катализирует реакцию образования L-глутамина из L-глутаминовой кислоты и аммиака:

 

глутаминсинтетаза

НООС–СН–СН2–СН2–СООН +   NН3   +   АТФ

| NH2

L-Глутаминовая кислота

НООС–СН–СН2–СН2–СОNН2 +   АДФ   +   Н3РО4

| NH2

L-Глутамин

 

Ацил-КоА–синтетазы (КФ 6.2.1) катализируют реакции соединения жирных кислот с коферментом А, что приводит к образованию ацилкофер- ментов А — активированных форм жирных кислот:

О

||                                                                  ацил-КоА–синтетаза

R–C–OH     +      АТФ     +     HS–КоА

Жирная кислота                         Кофермент А

O

||

R–C~S–KoA     +     АМФ     +      è~è

Ацилкофермент А                         Пирофосфат

С реакции активирования жирных кислот начинается процесс их окис- лительного распада.

 

Аминоацил-тРНК–синтетазы (КФ 6.1.1) участвуют в процессе синте- за белков, катализируя реакцию активации аминокислот и присоединения их к молекулам тРНК:

 

 

 

H2N–CH–COOH  +   тРНК  +   АТФ

| R

Аминокислота

 

аминоацил-тРНК–синтетаза

 

 

 

 

 

O

||

 

H2N–CH–C~O–тРНК +   АМФ   +   è~è

| R

Аминоацил-тРНК                     Пирофосфат

 

 

3.8.   Множественные молекулярные формы ферментов

Полный набор белков организма определяется совокупностью всех его генов. При этом в структуре ДНК отдельных организмов в процессе эволю- ционного развития живого мира происходят изменения, которые в результате наследования могут постепенно распространяться в популяциях. Изменение генетического состава популяций служит основой для образования новых биологических видов. Поэтому у разных видов организмов белки, обладаю- щие одной и той же биологической функцией, могут несколько различаться между собой по аминокислотному составу.

Это в полной мере относится и к ферментам, многие из которых встре- чаются в живой природе в виде множественных молекулярных форм. Такие ферменты, выполняя у организмов разных видов одну и ту же каталитиче- скую функцию, т. е. имея одно и то же наименование, различаются между собой по содержанию и последовательности аминокислотных остатков, по структуре молекулы, а следовательно, по физико-химическим и другим свой- ствам.

Множественные молекулярные формы  ферментов  хорошо изучены,  в

частности на примере  α-амилаз различного происхождения: грибных,  бакте-

 

риальных, ячменного солода. Различия в аминокислотном составе этих фер- ментов приводят к тому, что α-амилазы из разных источников довольно зна- чительно различаются, например, по термостабильности.

Более того, некоторые ферменты присутствуют в виде разных молеку- лярных форм в различных органах и тканях одного и того же организма. Та- кие разнообразные молекулярные формы фермента у организмов одного биологического вида называют изоферментами, или изоэнзимами. Изофер- менты катализируют одну и ту же реакцию, но различаются строением моле- кулы и некоторыми физико-химическими свойствами. Эти ферменты состоят из нескольких субъединиц, которые, комбинируясь различными способами, образуют четвертичную структуру фермента. Таким образом, молекулярная гетерогенность изоферментов также имеет генетическую основу и обуслов- лена наличием нескольких генов, каждый из которых кодирует одну субъе- диницу фермента.

Впервые изоферменты были обнаружены у фермента лактатдегидроге- назы, представляющей собой белок, обладающий четвертичной структурой и состоящий из четырёх субъединиц двух типов — Н (англ. “heart” — сердце) и М (англ. “muscle” — мышца). Эти формы фермента были выделены соот- ветственно из сердечной и скелетной мышцы цыплёнка. Субъединицы Н и М представляют собой белки с различной первичной структурой. Общее число молекулярных форм лактатдегидрогеназы, обнаруженных у цыплят, а также у других организмов, равно пяти: НННН, НННМ, ННММ, НМММ и ММММ.

Поскольку изоферменты различаются по своим свойствам, то характер их распределения отражает регуляторные механизмы, контролирующие ме- таболизм. Так, изоферменты лактатдегидрогеназы НННН и НННМ проявля- ют высокую активность в аэробных условиях, когда пировиноградная кисло- та быстро окисляется до СО2 и Н2О, а изоферменты НМММ и ММММ — в анаэробных условиях, когда пировиноградная кислота восстанавливается до молочной кислоты.

 

В настоящее время число ферментов, у которых обнаружены множест- венные молекулярные формы, весьма велико. Кроме лактатдегидрогеназы, несколько изоферментов найдено у алкогольдегидрогеназы, каталазы, перок- сидазы, эстераз, амилаз, инвертазы, альдолазы, енолазы, ряда протеолитиче- ских ферментов и т. д.

 

3.9.   Применение ферментов

Ферменты способны сохранять свою каталитическую активность и по- сле выделения из биологических объектов, что делает возможным их широ- кое практическое применение в виде ферментных препаратов.

В настоящее время ферментные препараты широко используют в раз- личных отраслях пищевой промышленности: хлебопечении, пивоварении, спиртовом, крахмало-паточном, кондитерском производствах, виноделии, производстве соков и безалкогольных напитков, сыроделии, производстве молока, мясном производстве и др.

Однако при применении ферментных препаратов в пищевых производ- ствах следует учитывать, что перерабатываемое сырьё имеет биологическое происхождение и, следовательно, уже содержит многочисленные ферменты, оказывающие самое существенное влияние на ход технологического процес- са, выход и качество готового продукта. Поэтому технолог пищевых произ- водств должен уметь управлять ферментативными процессами, протекаю- щими в перерабатываемом сырье, стимулируя действие одних ферментов, оказывающих положительное влияние на ход технологического процесса, и подавляя действие других — нежелательных ферментов, в основном окисли- тельных.

Если традиционные пищевые технологии исторически складывались с учётом наличия и активности собственных ферментов в перерабатываемом сырье, то после того как была создана новая отрасль промышленности, про- изводящая ферментные препараты, положение стало коренным образом из- меняться.

 

Путём введения дополнительного количества фермента в виде фер- ментного препарата технолог пищевых производств получает возможность интенсифицировать те или иные этапы технологического процесса. Таким образом, биохимические процессы, протекающие при переработке пищевого сырья, связаны как с действием его собственных ферментов, так и с действи- ем ферментных препаратов, вносимых в ходе технологического процесса.

Как правило, ферментные препараты получают из микроорганизмов: плесневых грибов или бактерий. Их выпускают с разной степенью очистки. Высокоочищенные ферментные препараты очень дороги, а малоочищенные содержат значительное количество балластных веществ и, кроме того, явля- ются комплексными, т. е. помимо основного компонента содержат какое-то количество других ферментов. Часто это создаёт трудности в использовании таких ферментных препаратов.

В пищевой промышленности широкое практическое применение полу- чили препараты протеаз, амилаз, липазы, каталазы, инвертазы, целлюлаз, пектолитических и ряда других ферментов.

Так, в хлебопекарной промышленности используют ферментные пре- параты амилаз и протеаз. Они ускоряют на 30 % процесс созревания теста, способствуют улучшению аромата хлеба, увеличению его объёма и пористо- сти мякиша, а также предотвращают процесс черствения, механизм которого определяется некоторыми изменениями в крахмале и белках хлеба при его хранении. Черствению хлеба также препятствует применяемая в хлебопече- нии липаза.

Для производства хлеба с очень белым мякишем применяют препараты липоксигеназы, которая вызывает отбеливание муки и ускоряет её созрева- ние.

Амилазы различного происхождения используют также в пивоварении и спиртовом производстве для замены солода. Это позволяет интенсифици- ровать процесс брожения и увеличить выход спирта. В пивоварении для ос-

 

ветления пива применяют протеолитические ферменты, главным образом па- паин.

Амилазы нашли своё применение также в крахмало-паточной про- мышленности при производстве растворимого крахмала, патоки, кристалли- ческой глюкозы. В отличие от кислотного ферментативный способ производ- ства оказался экологически наиболее эффективным.

Для получения в качестве заменителей сахарозы глюкозо-фруктозных сиропов с преимущественным содержанием фруктозы в крахмало-паточной промышленности используют глюкозоизомеразу (КФ 5.3.1.18), катализи- рующую реакцию изомеризации D-глюкозы в D-фруктозу.

В кондитерском производстве при изготовлении мучных изделий при- меняют ферментные препараты, обладающие протеолитической и амилоли- тической активностью, а при изготовлении сахаристых изделий — инвертазу дрожжей, превращающую сахарозу в глюкозу и фруктозу (инвертный сахар), что предотвращает кристаллизацию сахарозы.

Для улучшения аромата кондитерских изделий применяют липазу, под воздействием которой образуются свободные жирные кислоты. При низких концентрациях свободных жирных кислот аромат изделий усиливается, при средних — появляется аромат масла, а при высоких — возникает аромат сы- ра.

При производстве плодово-ягодных соков и вин применяют препараты пектолитических и протеолитических ферментов с целью осветления про- дукта и увеличения его выхода. Для получения плодово-ягодных соков с мя- котью, имеющих однородную консистенцию и не подвергающихся расслаи- ванию, используют целлюлазы. Для стабилизации и предотвращения порчи готовых соков, вин и безалкогольных напитков используют ферментный препарат глюкозооксидазы и каталазы, предотвращающий окислительные процессы за счёт удаления кислорода в результате реакции окисления глюко- зы, а также образующегося Н2О2. Применение этого препарата позволяет в течение длительного времени сохранять букет розовых и белых вин.

 

Целлюлазы применяют также при изготовлении растворимого кофе, морковного джема, для обработки плодов цитрусовых, улучшения конси- стенции грибов и овощей.

В сыроделии для процесса створаживания молока используют протео- литический фермент реннин (КФ 3.4.23.4), называемый также сычужным ферментом, т. к. он впервые был выделен из сычуга (четвёртого отдела же- лудка) телёнка. Вытяжки из сычугов молочных телят, возраст которых не превышает 10 дней, — основной источник реннина в сыроделии. В качестве замены дефицитного сычужного фермента для коагуляции молока применя- ют также препараты протеолитических ферментов микробного происхожде- ния. Для улучшения вкусовых свойств производимых сыров используют ли- пазу, а для удаления избытка Н2О2, которая применяется в качестве консер- ванта при обработке молока, используют каталазу.

При производстве молочной продукции для стабилизации молока при- меняют препараты протеаз. Так, после обработки молока трипсином оно меньше окисляется и в течение двух недель сохраняет свой первоначальный вкус. Для удаления из молока остатков пероксида водорода, применение ко- торого заменяет процесс пастеризации, проводимый с целью уничтожения патогенной микрофлоры и приводящий к частичной потере естественных ферментов молока, используют каталазу. В производстве сухого молока при- меняют липазу.

В мясной промышленности для мягчения разделанных мясных туш и повышения выхода мяса применяют протеолитические ферменты, в основ- ном папаин.

Помимо отраслей пищевой промышленности, ферментные препараты широко применяются также в кожевенном и меховом производствах, тек- стильной промышленности, сельском хозяйстве, бытовой химии, медицине, химическом синтезе и т. д.

В кожевенном производстве для быстрого и качественного обезвола- шивания шкур, мягчения кожевенного сырья, повышения сортности и каче-

 

ства кож применяют препараты протеиназ, в основном трипсин. Протеазы ускоряют также процессы получения высококачественной продукции в ме- ховом производстве.

В текстильной промышленности для удаления из тканей крахмального клейстера, которым пропитывают нити, чтобы сделать их более гладкими и придать им большую прочность, используют препараты амилаз, а для пере- работки льносоломы и получения из неё льноволокна — пектолитические ферменты. Для получения «состаренных» джинсов взамен абразивной обра- ботки их пемзой и химическими реактивами применяют целлюлазные препа- раты, которые способствуют частичному удалению индиго и депигментации джинсовой ткани. При производстве натурального шёлка используют неко- торые протеиназы, с помощью которых при размотке коконов тутового шел- копряда для высвобождения шёлковых волокон из шёлка-сырца удаляют склеивающий волокна белок серицин. Для обезжиривания волокон исполь- зуют липазу.

В сельском хозяйстве применяют препараты пектолитических фермен- тов и целлюлаз при производстве кормов, что позволяет повышать их усвоя- емость, а также ускорять процессы силосования зелёных кормов.

В бытовой химии в качестве компонентов энзиматических стиральных порошков и моющих средств используют протеолитические ферменты, вы- держивающие нагревание до 90 °С без заметной потери активности.

Некоторые протеазы вместе с глюкозооксидазой и каталазой добавля- ют в зубные пасты, что обеспечивает их антимикробное действие, защиту от кариеса зубов, а также эффективное растворение органического материала зубного налёта без повреждения живых тканей полости рта.

Ферменты находят разнообразное применение в медицине. Весьма эф- фективно использование протеаз, амилазы, липазы при заболеваниях желу- дочно-кишечного тракта. Протеолитические ферменты используют также для заживления гнойных ран, трофических язв и ожогов, растворения тромбов в кровеносных сосудах, удаления катаракт. Так как мёртвые клетки в отличие

 

от живых не способны защищать себя от воздействия протеаз, препараты этих ферментов способствуют размягчению омертвевших тканей, тем самым облегчая и ускоряя заживление ран. Для устранения явлений кислородного голодания при заболеваниях сердца, астматических состояниях применяют препараты цитохрома. Ряд ферментных препаратов применяют для воспол- нения дефицита ферментов в организме.

Многие ферменты эффективно используют в клинической диагностике. Например, данные об увеличении активности изофермента лактатдегидроге- назы НННН, альдолазы и др. служат для диагностики инфаркта миокарда, а данные об увеличении активности изофермента лактатдегидрогеназы ММММ, аланинаминотрансферазы и др. — для диагностики заболеваний пе- чени.

Помимо этого, ферменты применяют в фармацевтическом анализе для стандартизации и контроля качества лекарственных препаратов, а также в качестве аналитических реагентов. Широко используется, например, метод определения содержания в крови глюкозы с помощью глюкозооксидазы.

Поскольку ферменты имеют белковую природу и их синтез находится под генетическим контролем, известны многочисленные случаи наследуемых нарушений синтеза белков, приводящих к тяжёлым патологическим состоя- ниям — наследственным болезням, которые чаще всего связаны с недостат- ком одного или нескольких ферментов в результате подавления их синтеза. Это приводит к нарушениям тех или иных обменных процессов и, как след- ствие, развитию различных заболеваний, например таких как фенилкетону- рия, обусловленная нарушением обмена фенилаланина, галактоземия, вы- званная нарушением процесса превращения галактозы в глюкозу, и многих других.

С целью коррекции метаболических нарушений из рациона питания больных исключают продукты, содержащие вещества, метаболизм которых нарушен в связи с дефицитом соответствующего фермента, организуют ин- дивидуальное лечебное питание с использованием специальных пищевых

 

продуктов с низким содержанием этих веществ, применяют препараты, свя- зывающие токсичные продукты, образующиеся в результате блокирования определённых биохимических реакций, а также разрабатывают методы кор- рекции генетических дефектов с применением генной инженерии.

Высокоочищенные ферментные препараты служат в качестве специ- фических средств биохимического анализа в научных исследованиях. На- пример, препараты протеолитических ферментов применяют в лабораториях для установления строения белков и пептидов. Всё большее применение ферменты находят в тонком органическом синтезе в процессах получения различных сложных соединений: аминокислот, пептидов, нуклеотидов, анти- биотиков.

 

3.9.1. Иммобилизованные ферменты

Долгое время в различных производствах применялись препараты сво- бодных ферментов. Однако, как вещества белковой природы, они неустойчи- вы при хранении и очень чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, из-за трудностей отделения таких ферментных препаратов от продуктов реакции они не могут быть использованы многократно. Поэтому срок ис- пользования таких ферментных препаратов составляет всего лишь один про- изводственный цикл.

Значительный прогресс в изучении строения и свойств многих фермен- тов позволил создать производство ферментных препаратов длительного действия. Многократное использование ферментов становится возможным в случае их закрепления в активной форме на каком-либо нерастворимом в во- де носителе. Такие ферменты, фиксированные тем или иным способом на инертной матрице и сохранившие свою каталитическую активность, называ- ют иммобилизованными (лат. “immobilis” — неподвижный).

В качестве носителей для иммобилизации ферментов очень часто ис- пользуют высокогидрофильные полисахариды: целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Целлюлоза и её производные обладают большой механи-

 

ческой прочностью, а декстран, агароза и их производные (сефадексы, сефа- розы) образуют достаточно плотные гели. Нередко для иммобилизации фер- ментов применяют полиакриламид, нейлон, силикагель, глины, пористое стекло, активированный уголь, а также другие носители.

Таким образом, носитель может быть как природным веществом, так и синтетическим. Недостатком природных носителей является их неустойчи- вость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость.

Матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой струк- туры, пластинчатой поверхности, плёнок или тканей, полых волокон, трубо- чек, капсул.

+

+

+

+

+

+

+

+

 

Существуют различные способы иммобилизации ферментов на тех или иных носителях: ковалентное связывание; молекулярная адсорбция; адсорб- ция за счёт электростатических взаимодействий; включение в поры геля; микрокапсулирование, т. е. включение в полупроницаемые микрокапсулы (рис. 49).

 

 

 

 

 

 

 

 

а)                      б)                      в)                           г)                         д) Рис. 49. Способы иммобилизации ферментов: а – ковалентное связывание;

б – молекулярная адсорбция; в – адсорбция за счёт электростатических взаимодействий; г – включение в поры геля; д – микрокапсулирование

 

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные способом кова- лентного связывания, отличаются высокой прочностью соединения фермента с носителем. Поэтому даже при широком варьировании условий протекания

 

катализируемой реакции, таких как рН среды и температура, фермент не от- деляется от носителя и не загрязняет образующихся продуктов реакции.

Однако при иммобилизации ферментов этим способом возможно изме- нение их субстратной специфичности, каталитической активности и других свойств. Поэтому присоединение фермента к носителю допускается только за счёт химических групп, не входящих в активный центр фермента и не участ- вующих в образовании фермент-субстратного комплекса. И поскольку это является очень непростой задачей, в крупномасштабных производственных процессах обычно используют ферменты, иммобилизованные иными спосо- бами.

Наиболее простым способом иммобилизации ферментов является их адсорбция на носителе. Она достигается при контакте водного раствора фер- мента с носителем. Адсорбированные молекулы ферментов удерживаются на поверхности носителя за счёт образования водородных связей, гидрофобных, электростатических или иных нековалентных взаимодействий, и поэтому прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока. Это ограничивает применение ферментов, иммобилизованных данным спо- собом.

Ферменты, иммобилизованные способом включения в гели или в мик- рокапсулы, лишены указанных недостатков. В первом случае молекулы фер- мента включаются в трёхмерную сетку из тесно переплетённых полимерных цепей, образующих гель, и так как среднее расстояние между соседними це- пями в геле меньше размера молекулы включённого фермента, он не может покинуть носитель и выйти в раствор. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой. В случае микрокапсулирования водный рас- твор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но не может пропустить крупные молекулы фермента. Инкапсулировать фермент можно внутрь полимерного микроконтейнера, липидного бислойного пу- зырька или обволакивающего гелеобразного соединения.

 

Данные способы применимы для иммобилизации практически любых ферментов. Будучи включёнными в гель или в микрокапсулы, ферменты приобретают стабильность и надёжную защиту от воздействия бактерий, крупные клетки которых не могут проникнуть в мелкие поры носителя или в микрокапсулы. В то же время имеются затруднения для доступа субстрата к ферменту. Поэтому данные способы иммобилизации ферментов непримени- мы для ферментативных превращений высокомолекулярных субстратов.

Таким образом, иммобилизованные ферменты имеют ряд очень важ- ных преимуществ перед своими нативными предшественниками. Они обла- дают высокой устойчивостью и легко могут быть отделены от реакционной среды, что позволяет останавливать реакцию в любой момент, использовать фермент многократно, а также получать не загрязнённый ферментом про- дукт. Кроме этого, ферментативный процесс можно осуществлять непрерыв- но, регулируя скорость катализируемой реакции, а следовательно, и выход конечного продукта.

Высокая эффективность иммобилизованных ферментов подтверждена успешно реализованными технологиями в промышленном масштабе.

Так, например, в пищевой промышленности получение глюкозо- фруктозных сиропов с преимущественным содержанием фруктозы происхо- дит с участием глюкозоизомеразы, иммобилизованной на целлюлозе, а для осветления пива применяют папаин, иммобилизованный на хитине (произ- водное целлюлозы).

Иммобилизовать, однако, можно не только отдельные ферменты, но и целые клетки. В этом случае отсутствуют затраты на выделение и очистку ферментов, а сами ферменты обладают более высокой активностью и ста- бильностью. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилиза- ции ферментов.

В настоящее время в производстве этилового спирта широко исполь- зуются иммобилизованные клетки дрожжей, а для быстрого получения уксу- са уже более 150 лет применяют клетки микроорганизмов, адсорбированных

 

на древесной стружке. Для получения аспарагиновой кислоты используют клетки кишечной палочки Escherichia coli, включённые в армированный по- лиакриламидный гель; период полужизни этого катализатора составляет 110 суток.

 

Вопросы для самоконтроля знаний

  1. Какую химическую природу имеют ферменты и какую функцию они выполняют?
  2. Когда был открыт первый фермент и какой?
  3. Что такое энергия активации химической реакции, какой физический смысл имеет это понятие?
  4. Нарисуйте энергетическую схему химической реакции и расскажите о механизме ферментативной реакции.
  5. Что такое субстрат?
  6. Каков биологический смысл образования комплекса ES?
  7. Что такое активный центр фермента и как он образуется?
  8. Какую роль играет активный центр в каталитическом действии фер- мента?
  9. Что Вы знаете о специфичности действия ферментов?
  10. Какова биологическая целесообразность специфичности действия ферментов?
  11. Какие различия существуют между ферментативным и нефермента- тивным катализом?
  12. Каким образом можно обнаружить действие фермента?
  13. Как можно судить о скорости ферментативной реакции?
  14. Нарисуйте график хода ферментативной реакции во времени.
  15. Что происходит со скоростью ферментативной реакции в течение времени её протекания и почему?
  16. Что такое начальная скорость ферментативной реакции и как она определяется?

 

 

ции?

 

  1. Как правильно выбирать продолжительность ферментативной реак-

 

 

  1. Нарисуйте график  зависимости скорости ферментативной реакции

 

от концентрации субстрата.

  1. При какой концентрации субстрата достигается максимальная ско- рость ферментативной реакции и почему дальнейшее повышение этой кон- центрации не приводит к увеличению скорости реакции?
  2. Нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации фермента.
  3. Что является мерой количества фермента?
  4. Расскажите о лабильности ферментов. Чем обусловлено это свойст- во ферментов?
  5. Как зависит действие фермента от температуры и рН среды? Нари- суйте соответствующие графики.
  6. Объясните, почему при температуре выше оптимальной каталити- ческое действие фермента снижается?
  7. Чем объясняется характерный вид кривых влияния рН на скорость ферментативной реакции?
  8. Что такое оптимальная температура и оптимальное значение рН для действия ферментов?
  9. В каком состоянии, в сухом или в растворённом, и при какой тем- пературе, при комнатной или в холодильнике, лучше сохраняется каталити- ческое действие фермента? Обоснуйте ответ.
  10. Что такое активаторы и ингибиторы ферментов?
  11. Какие Вы знаете активаторы ферментов? Расскажите о механизме активирования тиоловых ферментов.
  12. Какие существуют ингибиторы ферментов, чем обусловлено их различие?
  13. Расскажите о механизмах действия ингибиторов ферментов.
  14. Что Вы знаете об аллостерических ферментах?

 

 

 

 

ты?

 

  1. В чём биологическое значение лабильности ферментов?
  2. Чем различаются однокомпонентные и двухкомпонентные фермен-

 

 

  1. Что такое апофермент, кофермент, какова их химическая природа?

 

Приведите примеры коферментов.

  1. Приведите примеры двухкомпонентных ферментов, назовите хими- ческие группировки, входящие в их коферменты, и напишите реакции, ката- лизируемые этими ферментами.
  2. Какую роль в работе двухкомпонентных ферментов играют кофер- мент и апофермент?
  3. Расскажите об образовании активного центра у однокомпонентного и двухкомпонентного ферментов.
  4. Каковы принципы классификации ферментов?
  5. Что представляет собой шифр фермента?
  6. Как образуется рабочее название фермента?
  7. По какому принципу ферменты делятся на классы?
  8. Назовите классы ферментов и охарактеризуйте каждый из них.
  9. Приведите примеры ферментов для каждого из классов.
  10. Как называются ферменты, катализирующие перенос водорода, и чем они различаются?
  11. Чем обусловлена специфичность действия дегидрогеназ?
  12. Напишите схему многоступенчатого окисления субстрата.
  13. В чём преимущество многостадийности биологического окисления?
  14. Каков механизм обезвреживания пероксида водорода?
  15. Расскажите о специфичности действия пептид-гидролаз.
  16. Расскажите о протеиназах и специфичности их действия.
  17. Как протеиназы различаются по активному центру?
  18. Напишите реакцию активирования папаина.
  19. Что такое зимогены и каково их биологическое значение?
  20. Расскажите о пептидазах, в чём специфичность их действия?

 

  1. Какие ферментные препараты применяются в пищевой технологии?
  2. Приведите примеры ферментативных процессов в различных тех- нологиях.
  3. Как можно усилить ферментативную реакцию в ходе технологиче- ского процесса?
  4. Что такое иммобилизованные ферменты?
  5. В чём преимущество использования иммобилизованных фермен-

тов?

 

IV.   УГЛЕВОДЫ

Углеводы — очень важные представители природных соединений. Их можно считать одной из основ существования большинства организмов. Ус- тановлено, что в биосфере углеводов больше, чем всех других органических соединений вместе взятых. На долю углеводов приходится от 70 до 90 % су- хой массы растений и около 2 % сухих веществ животных организмов.

Название «углеводы» предложил в 1844 г. российский учёный К. Э. Г. Шмидт, т. к. химический анализ первых известных представителей соедине- ний этого класса показал, что они состоят из углерода, водорода и кислорода, причём водород и кислород содержатся в них в таком же соотношении, как и в воде. Элементный состав углеводов был выражен общей формулой Сx2О)y.

Однако позднее было выяснено, что такой же элементный состав име- ют и некоторые вещества неуглеводной природы, например, формальдегид, уксусная кислота, молочная кислота. В то же время некоторые углеводы, на- пример дезоксирибоза, имеют иное, отличное от выведенной общей форму- лы, соотношение водорода и кислорода. Тем не менее, широко распростра- нившийся термин «углеводы» сохранился.

 

4.1.   Биологическая роль углеводов

Функции углеводов в живых организмах чрезвычайно многообразны.

Основное биологическое значение этих веществ состоит в том, что они служат энергетическим материалом клетки. В качестве главного биологи- ческого топлива используется глюкоза.

Углеводы обладают способностью накапливаться в виде крахмала у растений и в виде гликогена в организме животных. Эти соединения выпол- няют функцию запасания питательных веществ. Они являются временным резервом глюкозы.

Некоторые углеводы выполняют структурную функцию. К ним отно- сится целлюлоза, образующая стенки растительных клеток, хитин, служащий

 

опорным компонентом наружного скелета членистоногих и клеточной стен- ки грибов. Ряд углеводов является основным компонентом межклеточного вещества соединительной ткани животных организмов.

Отдельные углеводы выполняют пластическую функцию. Например, рибоза и дезоксирибоза используются для построения нуклеиновых кислот, НТФ, НДФ, различных нуклеотидов.

Биологическая функция углеводов заключается также в том, что они играют роль источников углерода при биосинтезе соединений других клас- сов, например липидов, некоторых аминокислот. Связующим звеном между энергетическими и пластическими функциями углеводов служит глюкоза.

Многие углеводы выполняют защитную функцию. Например, в слизи- стых веществах, защищающих внутренние поверхности бронхов, сосудов, пищеварительного тракта от проникновения вирусов, бактерий, а также от механических повреждений, присутствуют мукополисахариды. В жидкости, смазывающей поверхности суставов, находится гиалуроновая кислота. В крови содержится гепарин, препятствующий её свёртыванию.

Углеводы, входящие в состав гликопротеидов и гликолипидов, распо- лагающихся на внешней поверхности клеток, играют роль рецепторов. Они отвечают за обеспечение специфичности групп крови, за узнавание клетками друг друга и образование контактов между ними, являются средством обще- ния клетки с окружающей средой, а также обуславливают способность орга- низма противостоять попаданию в него чужеродных веществ и вызывать от- торжение чужеродных тканей и органов при их пересадке.

Помимо этого, углеводы выполняют и другие важные биологические функции. Например, клетчатка пищи играет регуляторную роль, т. к. акти- вирует работу пищеварительного тракта. Регулирующую функцию выпол- няют и углеводы, препятствующие накоплению кетоновых тел при окисле- нии жиров. Осмотическое давление крови зависит от концентрации в ней глюкозы.

 

4.2.   Классификация углеводов

Все углеводы делят на две группы: простые и сложные. К простым уг- леводам относятся моносахариды, или монозы. Сложные углеводы — это по- лисахариды, или полиозы, среди которых различают две группы: полисаха- риды первого порядка, или олигосахариды, и полисахариды второго порядка (рис. 50).

Углеводы

 

 

Моносахариды (монозы)                      Полисахариды (полиозы)

 

 

Полисахариды первого порядка           Полисахариды второго порядка (олигосахариды)

Рис. 50. Классификация углеводов

 

Моносахариды не могут гидролизоваться с образованием более про- стых соединений, а полисахариды представляют собой полимеры моносаха- ридов.

Деление полисахаридов основано на степени их полимеризации. Оли- госахариды являются низкомолекулярными полимерами, при полном гидро- лизе они образуют от двух до десяти остатков моносахаридов. Это кристал- лизующиеся соединения. Можно установить их точную формулу.

Полисахариды второго порядка — это высокомолекулярные биопо- лимеры, включающие сотни и тысячи остатков моносахаридов. Они не обра- зуют ярко выраженных кристаллов. Их точная формула не установлена.

 

4.3.   Моносахариды

По химической природе моносахариды являются производными мно- гоатомных спиртов, у которых в молекуле наряду со спиртовыми группами содержится альдегидная или кетонная группа. Следовательно, моносахариды

 

представляют собой либо альдегидоспирты (альдозы), либо кетоспирты (кетозы). Они растворяются в воде, имеют сладкий вкус, образуют кристал- лы, могут полимеризоваться.

В природе встречается более 200 различных моносахаридов. Такое их большое многообразие обусловлено двумя причинами. Одна из них заключа- ется в том, что моносахариды могут содержать различное число атомов угле- рода в молекуле — от трёх до девяти. В зависимости от этого их делят на группы, имеющие соответствующие названия: триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, гептозы, октозы и нонозы (табл. 9). Моносахаридов с числом атомов углерода больше девяти в природе не обнаружено.

Наиболее распространены в живом мире гексозы и пентозы, среди ко- торых самым распространённым моносахаридом является глюкоза.

 

Пентозы, С5Н10О5:

О

1С                  1CH2OH

Гексозы, С6Н12О6:

О                         O

1С                        1C                    1CH2OH

|    H

|

|     H

|    H

|

H–2C–OH

2C=O

H–2C–OH

H–2C–OH

2C=O

|

|

|

|

|

H–3C–OH

H–3C–OH

HO–3C–H

HO–3C–H

HO–3C–H

|

|

|

|

|

H–4C–OH

H–4C–OH

H–4C–OH

HO–4C–H

H–4C–OH

|

|

|

|

|

5CH2OH

D-Рибоза

5CH2OH

D-Рибулоза

H–5C–OH

|

6CH2OH

H–5C–OH

|

6CH2OH

H–5C–OH

|

6CH2OH

 

 

D-Глюкоза

D-Галактоза

D-Фруктоза

 

Другая причина многообразия моносахаридов в природе — их изоме- рия. Встречается три вида изомерии моносахаридов.

Первый вид изомерии обусловлен наличием альдегидной или кетонной группы у моносахаридов с одинаковым числом атомов углерода. Такую изо- мерию называют структурной. Структурными изомерами являются, напри- мер, глюкоза и фруктоза, галактоза и фруктоза, рибоза и рибулоза.

 

Таблица 9 Примеры моносахаридов с различным числом атомов углерода

Число атомов углерода

 

Название моносахаридов

 

Примеры моносахаридов

альдозы

кетозы

3

Триозы

Глицериновый

альдегид

Дигидроксиацетон

4

Тетрозы

Эритроза

 

 

5

 

Пентозы

Рибоза,

дезоксирибоза, арабиноза, ксилоза

 

Рибулоза

6

Гексозы

Глюкоза, галактоза,

манноза

Фруктоза

 

Второй вид изомерии обусловлен наличием в молекулах моносахари- дов асимметрических атомов углерода и называется стереоизомерией, или пространственной изомерией. Стереоизомерия связана с неодинаковым про- странственным расположением отдельных атомов при одинаковом порядке их соединения между собой.

В 1906 г. американский химик российского происхождения М. А. Роза- нов предложил в качестве стандарта для определения стереоизомерии моно- сахаридов глицериновый альдегид. Этот простейший моносахарид имеет один асимметрический атом углерода (С*), у которого все четыре валентно- сти замещены различными атомными группами. Это означает, что существу- ет два стереоизомера этой альдозы, называемые D-глицериновый альдегид и L-глицериновый альдегид:

О

O

С

C

|     H

|     H

H – C* – OH

HO – C* – H

|

|

CH2OH

CH2OH

D-Глицериновый                  L-Глицериновый альдегид                               альдегид

 

Условно принято устанавливать конфигурацию всех остальных моно- сахаридов по их отношению к глицериновому альдегиду. Моносахариды, имеющие конфигурацию D-глицеринового альдегида, относят к D-ряду (лат. “dexter” — правый), а моносахариды, имеющие конфигурацию L-глицерино- вого альдегида, — к L-ряду (лат. “laevus” — левый).

Определить принадлежность моносахарида к тому или иному стерео- химическому ряду можно следующим образом. Если его углеродную цепоч- ку расположить на листе бумаги так, чтобы альдегидная или кетонная группа находилась наверху, то у соединений D-ряда ОН-группа у последнего асим- метрического атома углерода будет расположена справа, а у соединений L- ряда — слева.

Например, у глюкозы, относящейся к D-ряду, ОН-группа у 5-го угле- родного атома будет расположена справа, а у L-глюкозы — слева:

О                                                О

|    H

H – 2C* – OH

1C

|    H

HО – 2C* – H

|

|

HO – 3C* – H

H – 3C* – ОH

|

|

H – 4C* – OH

HO – 4C* – H

|

|

H – 5C* – OH

HО – 5C* – H

|

|

6CH2OH

6CH2OH

D-Глюкоза                               L-Глюкоза

 

Почти   все   моносахариды,   встречающиеся   в  природе,   относятся к

D-ряду и лишь некоторые их них распространены исключительно в L-форме. Если  для  глицеринового  альдегида,  содержащего  один асимметриче-

ский атом углерода, существует только два стереоизомера, то для других мо- носахаридов, содержащих несколько асимметрических атомов углерода, со- ответственно существует несколько стереоизомерных форм. Количество сте- реоизомеров можно подсчитать по формуле  2n,  где  n — число асимметриче-

 

ских атомов углерода. Например, у глюкозы это 2-й, 3-й, 4-й и 5-й атомы уг- лерода, а у фруктозы — 3-й, 4-й и 5-й атомы углерода. Следовательно, гексо- зы, относящиеся к альдозам, имеют 16 стереоизомеров, а гексозы, относя- щиеся к кетозам, — 8.

Из 16 стереоизомеров альдогексозы восемь форм относятся к D-изоме- рам (D-глюкоза, D-галактоза и др.) и восемь — к L-изомерам (L-глюкоза, L-га- лактоза и др.). Среди восьми стереоизомеров кетогексозы четыре D-формы и четыре L-формы.

Стереоизомеры обладают способностью отклонять плоскость поляри- зации поляризованного луча света, проходящего через их растворы, на тот или иной угол либо вправо, либо влево, т. е. являются оптически активными соединениями, что обусловлено наличием в их молекулах асимметрических атомов углерода. Направление вращения плоскости поляризации света обо- значают знаком (+) при её вращении по часовой стрелке, т. е. отклонении вправо, и знаком (–) — при её отклонении влево.

Из 16 стереоизомеров альдогексозы восемь форм относятся к право- вращающим и восемь — к левовращающим. Из восьми стереоизомеров ке- тогексозы четыре правовращающие формы и четыре — левовращающие.

Какая из двух форм (D- или L-) является правовращающей, а какая ле- вовращающей, можно установить только экспериментально. Символы «D» и

«L» указывают лишь на пространственную конфигурацию той или иной формы моносахарида, но не показывают направление вращения плоскости поляризации света.

Таким образом, моносахарид, принадлежащий к D- или L-ряду и вместе с тем вращающий плоскость поляризации света вправо, обозначается соот- ветственно как D(+) или L(+). Если же моносахарид D- или L-ряда вращает плоскость поляризации света влево, то его обозначают как D(–) или L(–). На- пример: D(+)-глюкоза, L(–)-глюкоза, D(–)-фруктоза, L(+)-фруктоза, D(–)-ри- боза.

 

Поскольку дигидроксиацетон (кетотриоза) не имеет асимметрических атомов углерода, оптической активностью он не обладает.

Стереоизомеры неравноценны биологически. Например, дрожжи сбра- живают только D(+)-глюкозу, но не могут осуществлять брожение на D(+)-галактозе, которая является стереоизомером глюкозы.

Третий вид изомерии моносахаридов, называемый таутомерией, обу- словлен возможностью их существования как в ациклической, так и в цикли- ческих формах.

Различают пиранозную и фуранозную циклические формы моносаха- ридов. Моносахариды в пиранозной форме представляют собой производные шестичленного гетероцикла пирана, а моносахариды в фуранозной форме — производные пятичленного гетероцикла фурана.

Превращение моносахарида в одну из циклических форм может проис- ходить только из ациклической формы. У альдогексоз (у глюкозы, галактозы и др.) пиранозная форма образуется за счёт взаимодействия альдегидной группы с ОН-группой, расположенной у 5-го углеродного атома, а фураноз- ная форма — за счёт взаимодействия альдегидной группы с ОН-группой, расположенной у 4-го углеродного атома. У кетогексоз (у фруктозы и др.) пиранозная форма образуется за счёт взаимодействия кетогруппы с ОН-груп- пой, расположенной у 6-го углеродного атома, а фуранозная форма — за счёт взаимодействия кетогруппы с ОН-группой, расположенной у 5-го углеродно- го атома.

Превращение ациклической формы моносахарида в циклическую со- провождается образованием кислородного «мостика». Его образование про- исходит за счёт взаимодействия альдегидной (у альдоз) или кетонной (у ке- тоз) группы со спиртовой группой моносахарида и представляет собой внут- римолекулярную реакцию образования полуацеталя или полукеталя:

О                                                    OH

R1 – C         +   R2 – OH                  R1 – C – O – R2 H                                               H

Альдегид          Спирт                       Полуацеталь

 

О                                                    OH

R1 – C         +   R3 – OH                  R1 – C – O – R3 R2                                              R2

Кетон              Спирт                       Полукеталь

 

Таким образом, в результате взаимодействия альдегидной или кетон- ной группы моносахарида с одной из своих ОН-групп образуется новая гид- роксильная группа, обладающая повышенной реакционной способностью. Её называют гликозидным гидроксилом. У альдоз гликозидный гидроксил располагается у первого атома углерода, а у кетоз — у второго.

При образовании циклических форм моносахаридов гликозидный гид- роксил может расположиться как над плоскостью пиранозного либо фура- нозного кольца, так и под ней. Поэтому в зависимости от положения глико- зидного гидроксила различают α- и β-изомеры моносахаридов. Для D-ряда справедливо, что если гликозидный гидроксил находится под плоскостью пиранозного или фуранозного кольца, то данный моносахарид присутствует в α-форме, а если гликозидный гидроксил располагается над плоскостью кольца, то возникает β-форма моносахарида.

Циклические формы моносахаридов обычно изображают перспектив- ными формулами, предложенными английским химиком У. Хеуорсом, в ко- торых фуранозное и пиранозное кольца представлены соответственно в виде почти правильных пяти- и шестиугольника, лежащих в одной плоскости. При написании перспективных формул Хеуорса руководствуются следующими правилами: заместители, находящиеся справа от углеродного остова молеку- лы моносахарида при её линейном изображении, помещаются ниже плоско- сти кольца при изображении молекулы в циклической форме, а заместители, находящиеся слева, занимают положение выше плоскости кольца.

Ниже рассмотрено образование циклических форм моносахаридов на примере D-глюкозы и D-фруктозы. Как видно из приведённых формул, при образовании циклических форм альдозы у неё становится асимметрическим также первый атом углерода, а при образовании циклических форм кетозы —

 

второй. Следовательно, число асимметрических атомов углерода в цикличе- ских формах моносахарида на один больше, чем в ациклической форме.

О

1С                                                                       гликозидный гидроксил

|    H

H –2C* – OH                      6СН2ОН                                 6СН2ОН

|                                  5C     ОН                                5C*     О HO –3C* – H                                  H    Н                  O                  H   Н            H

|                           4 C                   1C                     4C*                         1C*

 

H –4C* – OH              HO    OH

|                                  3C        2C

 

HO   OH    Н OH

 

H –5C* – OH                       H         OH                             H       OH

|

6CH2OH                                                            α-D-Глюкопираноза

D-Глюкоза

 

1CH2OH                                                             гликозидный гидроксил

|

2C = O                  6                                                                                 6

|                     НОСН2    ОН                            НОСН2    О HO –3C* – H                                           О

|                         5С                  2 С                       5С*

H –4C* – OH                    Н      НО                                   Н      НО

|                          Н 4С        3С   СН2ОН               Н 4С*       3С* СН2ОН H –5C* – OH                          ОН      Н  1                               ОН      Н   1

|

6CH2OH                                                               β-D-Фруктофураноза

D-Фруктоза

 

Схемы таутомерных взаимопревращений в водном растворе наиболее важных представителей моносахаридов — глюкозы и фруктозы представле- ны на стр. 265.

Как видно, в водном растворе одновременно присутствуют все его формы. Они находятся в состоянии динамического равновесия и через ацик- лическую форму могут взаимно превращаться друг в друга. Однако содержа- ние в растворе различных форм моносахарида неодинаково. Так, например, в

 

Схема таутомерных превращений глюкозы: СН2ОН                                                                                       СН2ОН

 

НО  С  Н   О       Н

 

 

ОН

 

Н  ОН    Н

 

 

Н       О

С

|

Н – С – ОН                       Н        ОН

 

Н       ОН                               |                          α-D-Глюкопираноза α-D-Глюкофураноза                  НО – С – Н

|

СН2ОН                                Н – С – О – Н

ОН

 

|                                  СН2ОН

 

НО  С   Н О

 

Н   ОН     Н Н Н        ОН

 

Н – С – О – Н

| СН2ОН

 

D-Глюкоза

(ациклическая форма)             Н         ОН

 

β-D-Глюкофураноза                                                    β-D-Глюкопираноза

 

Схема таутомерных превращений фруктозы:

Н

 

 

НОН2С       О       СН2ОН

 

ОН

 

Н   Н     НО

 

 

 

СН2ОН

|

С = О                       ОН       Н

 

ОН     Н                                 |                         α-D-Фруктопираноза α-D-Фруктофураноза               НО – С – Н

|

Н – С – О – Н

ОН

 

|                               Н

 

НОН2С      О

 

Н   Н     НО

 

ОН      Н

 

 

 

СН2ОН

 

Н – С – О – Н

| СН2ОН

 

D-Фруктоза

(ациклическая форма)         ОН      Н

 

β-D-Фруктофураноза                                                 β-D-Фруктопираноза

 

водном растворе глюкозы содержание α-D-глюкопиранозы составляет при- близительно 35 %, β-D-глюкопиранозы — 63 %, ациклической формы — 1 %, суммарное содержание α-D-глюкофуранозы и β-D-глюкофуранозы — 1 %. Таким образом, в водном растворе глюкозы преобладают наиболее устойчи- вые для неё пиранозные формы. Для фруктозы, напротив, наиболее устойчи- выми являются фуранозные формы, и именно они преобладают в её водном растворе.

При растворении кристаллов моносахарида в воде поначалу наблюда- ется постепенное изменение величины угла вращения плоскости поляриза- ции луча света, проходящего через данный свежеприготовленный раствор,   т. к. в нём происходит образование всех таутомерных форм моносахарида, имеющих разные величины угла вращения. Это свойство моносахаридов по- лучило название явления мутаротации. Через некоторый промежуток вре- мени, когда устанавливается определённое соотношение α- и β-форм моноса- харида и наступает состояние их динамического равновесия, происходит ста- билизация угла вращения плоскости поляризации света.

Например, при растворении в воде кристаллов α-D-глюкопиранозы или β-D-глюкопиранозы часть их молекул переходит в ациклическую форму, а при повторном замыкании цикла гликозидный гидроксил может занять как  α- так и β-положение. Так осуществляется переход одной циклической фор- мы моносахарида в другую, обуславливающий явление мутаротации. Вели- чина удельного вращения для α-D-глюкопиранозы составляет + 112,2°, а для β-D-глюкопиранозы — + 18,7°.

Поскольку при растворении в воде α-D-глюкопиранозы часть её моле- кул превращается β-D-глюкопиранозу, то удельное вращение данных раство- ров постепенно понижается, достигая постоянной величины + 52,7°. И на- оборот, при растворении в воде β-D-глюкопиранозы часть её молекул пре- вращается в α-D-глюкопиранозу, и удельное вращение её водных растворов постепенно возрастает, тоже останавливаясь на величине + 52,7°. Таким об- разом, установление динамического равновесия между всеми таутомерными

 

формами в растворе D-глюкозы наступает, когда его удельное вращение дос- тигает величины + 52,7°, т. е. становится постоянным.

 

4.4.   Производные моносахаридов

В природе моносахариды встречаются чаще всего не в свободном виде, а в форме различного рода производных: фосфорных эфиров, продуктов вос- становления и окисления, гликозидов, нуклеозиддифосфатсахаров.

Фосфорные эфиры моносахаридов. Во всех процессах углеводного обмена и у животных, и у растений, и у микроорганизмов обязательно при- нимают участие фосфорные эфиры моносахаридов. Самым распространён- ным среди них является D-глюкозо-6-фосфат, который образуется из D-глю- козы в результате следующей реакции:

СН2ОН                                                     СН2Оè

О                                                             О

Н Н              Н                                         Н  Н              Н

(α)     +     АТФ                                         (α)     +     АДФ

НО  ОН      Н ОН                                   НО  ОН      Н ОН

Аденозин-                                                Аденозин-

Н         ОН        трифосфорная              Н         ОН           дифосфорная

D-Глюкоза             кислота           D-Глюкозо-6-фосфат        кислота

 

Данную реакцию катализирует фермент гексокиназа (КФ 2.7.1.1), отно- сящийся к фосфотрансферазам, который переносит остаток фосфорной ки- слоты от АТФ на молекулу глюкозы. Образующийся при этом фосфорный эфир глюкозы существует преимущественно в ациклической форме, что де- лает моносахарид благодаря наличию у него свободной альдегидной группы более реакционноспособным.

Глюкозо-6-фосфат является биологически активной формой глюкозы, способной вступать в реакции обмена углеводов — их биосинтеза, взаимных превращений и распада. Схема взаимных превращений различных активиро- ванных форм гексоз представлена на рис. 51. Очевидно, что при поступлении в клетку глюкозы она может превращаться в те или иные гексозы в зависи- мости от потребности в них.

 


Глюкозо-6- фосфат                              Фруктозо-6-фосфат

Глюкозо-1-фосфат                                Маннозо-6-фосфат

 

Галатозо-1-фосфат

 

Рис. 51. Взаимопревращения фосфорных эфиров гексоз

 

Продукты восстановления моносахаридов. В результате восстанов- ления моносахаридов в мягких условиях из них образуются соответствую- щие многоатомные спирты. При этом у альдоз происходит восстановление альдегидной группы, а у кетоз — кетонной.

Так, при восстановлении глюкозы или фруктозы образуется сорбит, при восстановлении галактозы — дульцит, при восстановлении маннозы — маннит, при восстановлении рибозы — рибит, при восстановлении ксилозы

— ксилит:

 

 

CH2OH

СH2ОН

СH2ОН

СH2ОН

СH2ОН

|

|

|

|

|

H – C – OH

H – C – OH

НО – С – Н

H – C – OH

H – C – OH

|

|

|

|

|

HO – C – H

HO – C – H

HO – C – H

H – C – ОH

HO – C – H

|

|

|

|

|

H – C – OH

HО – C – H

H – C – OH

H – C – ОH

H – C – ОH

|

|

|

|

|

H – C – OH

|

H – C – OH

|

H – C – OH

|

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

 

 

Сорбит             Дульцит             Маннит               Рибит              Ксилит

 

Эти спирты наиболее часто встречаются в природе. Наиболее широко они представлены в растениях: в плодах, ягодах, овощах, а также в грибах и водорослях, в сладковатом соке древесных растений. Например, в плодах рябины содержится до 7 % сорбита.

 

Сорбит и ксилит используются как заменители сахара в диабетических продуктах в питании больных диабетом и ожирением. Ксилит, например, в два раза слаще сахарозы, однако он не усваивается в организме человека.

Продукты окисления моносахаридов. Альдозы легко окисляются, причём в зависимости от условий окисления из них образуются различные продукты (рис. 52).

В мягких условиях, например при использовании бромной воды, окис- ляется только альдегидная группа, и в результате реакции получаются аль- доновые кислоты. При окислении глюкозы таким способом образуется глю- коновая кислота. Её образование наблюдается, в частности, при заплесневе- нии растворов глюкозы. При окислении альдегидной группы галактозы обра- зуется галактоновая кислота. Кетозы в этих условиях не окисляются.

При более жёстких условиях окисления, например под воздействием разбавленной HNO3, у альдоз окисляется не только альдегидная, но и пер- вичная спиртовая группа, вследствие чего образуются двухосновные гидро- ксикислоты. Они получили название альдаровых кислот. При таком окис- лении глюкозы из неё образуется глюкаровая (сахарная) кислота, а при окис- лении галактозы — галактаровая (слизевая). Окисление кетоз азотной кисло- той протекает с расщеплением С–С-связей.

Наибольшее биологическое значение имеют широко распространённые в природе уроновые кислоты. Они образуются если у альдозы окислить только первичную спиртовую группу. В лабораторных условиях уроновые кислоты можно получить лишь многостадийным синтезом, т. к. чтобы окис- лить первичную спиртовую группу и сохранить альдегидную, последнюю нужно предварительно защитить, например, превращением альдозы в глико- зид. В результате окисления первичной спиртовой группы глюкозы образует- ся глюкуроновая кислота, галактозы — галактуроновая, маннозы — манну- роновая.

 

О

С

|    Н

(СНОН)4

| СН2ОН

Альдогексоза

 

 

О

СООН                                   СООН                                 С

|                                              |                                           |    Н (СНОН)4                                (СНОН)4                              (СНОН)4

|                                              |                                           |

СН2ОН                                  СООН                                 СООН

Альдоновые                           Альдаровые                         Уроновые кислоты                                 кислоты                               кислоты

 

Рис. 52. Схема окисления альдоз

 

Итак, при окислении D-глюкозы образуются следующие кислоты:

О

COOH

СООН

C

|

|

|    H

H – C – OH

H – C – OH

H – C – OH

|

|

|

HO – C – H

HO – C – H

HO – C – H

|

|

|

H – C – OH

H – C – OH

H – C – OH

|

|

|

H – C – OH

H – C – OH

H – C – OH

|

|

|

CH2OH

COOH

COOH

D-Глюконовая

D-Глюкаровая

D-Глюкуроновая

кислота

кислота

кислота

 

Альдоновые и уроновые кислоты встречаются в природе в виде компо- нентов полисахаридов и как промежуточные продукты в углеводном обмене.

Альдоновые кислоты образуются и при окислении моносахаридов в щелочной среде катионами металлов Cu2+ или Ag+. В щелочной среде моно- сахариды переходят в ациклическую форму, и, следовательно, гликозидный

 

гидроксил переходит в альдегидную или кетонную группу. При взаимодей- ствии альдегидных групп моносахаридов с катионами металлов происходит окисление альдегидной группы до карбоксильной, т. е. образование альдоно- вых кислот, и восстановление катионов металлов. Кетозы также проявляют восстанавливающие свойства, т. к. в щелочной среде происходит их изомери- зация в альдозы.

Немецкие химики Г. Х. Фелинг и Б. Х. Г. Толленс предложили реакти- вы, позволяющие проводить эти реакции окисления. Реактив Фелинга пред- ставляет собой комплекс Cu2+ с двойной калиево-натриевой солью винной кислоты (сегнетовой солью), а реактив Толленса — гидроксид диамминсе- ребра (I) [Ag(NH3)2]OH.

В ходе реакции моносахаридов с фелинговой жидкостью катион Cu2+ восстанавливается с образованием оксида меди (I) Cu2O, выпадающего в ви- де осадка красного цвета:

O           О–СН–СООК                         O HO–CH–COOK

R–C      + 2Cu                                        + 2H2O    R–C                                  + 2    + Cu2O↓ H                                        О–СН–СООNa                                    OH                              HO–CH–COONa

Альдоза     Реактив Фелинга                Кислота       Сегнетовая соль

 

При взаимодействии моносахаридов с реактивом Толленса катион Ag+ восстанавливается до металлического серебра, оседающего на стенках реак- ционного сосуда в виде блестящего налёта. Данная реакция известна как ре- акция «серебряного зеркала»:

O                                                         O

R–C       +   2[Ag(NH3)2]OH               R–C          +   2Ag↓   +   4NH3   +   H2O H                                                       OH

Альдоза     Реактив Толленса            Кислота

 

Обе реакции протекают при нагревании.

Углеводы, способные восстанавливать реактивы Фелинга и Толленса, называют восстанавливающими, или редуцирующими. Эти реактивы вос- станавливают все моносахариды, т. к. все они содержат свободную карбо-

 

нильную группу (в циклической форме моносахарида — свободный глико- зидный гидроксил). Многие олигосахариды не содержат свободной карбо- нильной группы, т. е. не имеют свободного гликозидного гидроксила. Они не дают реакции с реактивами Фелинга и Толленса и называются невосстанав- ливающими, или нередуцирующими.

Реактив Фелинга очень широко применяется для количественного оп- ределения углеводов. Метод их определения в 1906 г. разработал француз- ский химик Г. Э. Бертран. Он основан на определении количества образую- щегося в ходе реакции оксида меди (I), зная которое можно рассчитать коли- чество имевшихся в растворе углеводов. Определить количество невосста- навливающих полисахаридов этим методом возможно лишь после их пред- варительного гидролиза до моносахаридов и внесения поправок в расчёты.

Гликозиды. Важнейшим свойством моносахаридов является их спо- собность к образованию гликозидов. Реакции их синтеза протекают с участи- ем гликозидного гидроксила. Этот гидроксил отличается от других гидро- ксильных групп моносахарида большей реакционной способностью: он мо- жет реагировать с каким-либо соединением неуглеводной природы — так на- зываемым агликоном, в качестве которого могут выступать разнообразные соединения. Возникающая при этом связь называется гликозидной.

Если моносахарид, участвующий в реакции образования гликозидов, находится α-форме, то образуются α-гликозиды, а если в β-форме — то β-гликозиды. Соответственно в α-гликозидах присутствует α-гликозидная связь, а в β-гликозидах — β-гликозидная связь, например:

 

СН2ОН                                                  СН2ОН

О                                                          О α-гликозидная связь

Н Н              Н                                     Н  Н              Н

+   НО – R                                                   +   H2O

НО   ОН     Н   ОН                                НО  ОН      Н        О–R

 

Н        ОН                                             Н         ОН

α-Глюкоза             Спирт                  α-Гликозид

 

СН2ОН                                                  СН2ОН   β-гликозидная связь О                                                             О

Н Н               ОН                                  Н  Н                   О – R

+   НО – R                                                     +   H2O

НО   ОН      Н   Н                                  НО   ОН      Н Н

 

Н         ОН                                            Н         ОН

β-Глюкоза              Спирт                    β-Гликозид

 

α- и β-Гликозиды не являются таутомерными формами одного вещест- ва. Это разные соединения, т. к. между ними не может происходить тауто- мерных взаимопревращений.

Гидролиз гликозидов может происходить по гликозидной связи под воздействием ферментов, которые называются гликозидазами (КФ 3.2.). α- и β-Гликозиды резко отличаются по отношению к гликозидазам: α-гликозид- ные связи гидролизуются только ферментами α-гликозидазами, а β-глико- зидные — только ферментами β-гликозидазами. В этом проявляется важ- нейшее свойство ферментов — специфичность их действия. Таким образом, гликозидазы обладают высокой специфичностью действия по отношению к типу гликозидной связи.

В организме животных не всегда содержатся ферменты